[发明专利]一种鱇浪白鱼心脏细胞系的构建方法

摘要

本发明涉及一种鱇浪白鱼心脏细胞系的构建方法，属于淡水生物细胞培养技术领域。该方法以鱇浪白鱼心脏组织为材料，清洗剪碎后，采用透明质酸酶和II型胶原酶联合消化获得游离心脏细胞和疏松组织块，接种于25cm2培养瓶中，加入含有胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子和硫酸软骨素的L-15培养液，置于28℃培养箱培养。每隔3天半更换培养液，待细胞长成单层后，采用胰蛋白酶消化法进行传代。本发明的有益效果在于：1、操作简便；2、构建的鱇浪白鱼心脏细胞系的细胞生长状态良好，形态为成纤维样细胞，能连续传代40代以上，直接用于环境毒理学研究环境污染物的模型，进行污染检测和安全性评价；3、该方法也适用于其他鱼类构建心脏细胞系。

主权项

一种鱇浪白鱼心脏细胞系的构建方法，其特征在于该构建方法的具体步骤如下：a.制备细胞培养液选择L‑15培养基，向培养基中加入胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子和硫酸软骨素，使胎牛血清的终浓度为20%，人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为3 ng/ml，硫酸软骨素的浓度为0.5 µg/ml。pH值为7.0‑7.4，置于4℃冰箱中保存，备用；b.原代培养先用8 mg/L高锰酸钾浸泡鲜活鱇浪白鱼10 min，对鱼进行整体消毒，以75%酒精再次消毒，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其心脏，置于12孔板中，加入PBS+200 IU/ml青霉素+200 µg/ml链霉素+100 µg/ml庆大霉素的溶液浸泡心脏组织，浸泡20 min后，将心脏组织用PBS+200 IU/ml青霉素+200 µg/ml链霉素+100 µg/ml庆大霉素的溶液清洗三次，剪成组织小块，用0.5%透明质酸酶和0.2%II型胶原酶联合消化30 min，收集心脏组织块，并将其均匀接种于25 cm2细胞培养瓶中，28℃培养箱中，正置干贴过夜，次日加入L‑15+20%FBS+3 ng/ml bFGF+0.5 µg/ml硫酸软骨素+100 IU/ml青霉素+100 µg/ml链霉素的细胞培养液5ml，在28℃培养箱中启动原代培养，每隔3天半量更换培养液，第8天细胞开始迁出，第45天细胞长成单层； c.继代培养待细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，用不含抗生素的PBS溶液清洗两遍，加入0.125%的胰蛋白酶1.5 ml，消化2 min，细胞变圆后，加入L‑15+20%FBS+3 ng/ml bFGF+0.5 µg/ml硫酸软骨素+100 IU/ml青霉素+100 µg/ml链霉素的细胞培养液8.5 ml，用吸管吹打，制成细胞悬液；然后接种于两个新培养瓶内，原贴有心脏组织块的培养瓶亦加入L‑15+20%FBS+3 ng/ml bFGF+0.5 µg/ml硫酸软骨素+100 IU/ml青霉素+100 µg/ml链霉素的细胞培养液5 ml，在28℃培养箱中培养；以后7天传代一次，传至第2代时，培养液中的抗生素浓度减半，传至第3代时，将培养瓶中的培养液替换成L‑15+20%FBS+3 ng/ml bFGF+0.5 µg/ml硫酸软骨素的细胞培养液5ml，传至第8代时，将培养液中血清含量降至10%，此时，细胞系建立成功。