[发明专利]一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法

摘要

本发明公开了一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，包括如下步骤：（1）预培养：欧美杂种山杨在1/2MS培养基上继代繁殖得到组培苗；选取生长状态良好的组培苗上带有部分叶片的叶柄作为外植体，将外植体暗培养；（2）农杆菌的培养：携带双元载体pMP90、pBI121的农杆菌C58培养得到侵染液；（3）共培养与芽的诱导：将预培养后的外植体浸于侵染液中培养。本发明的方法从外植体选择、遗传转化条件优化等方面建立欧美杂种山杨高效遗传转化体系，本发明的方法遗传转化效率高。通过建立高效的欧美杂种山杨遗传转化体系，可在短时间内培育出杂种山杨抗逆新品种，对杨树抗性改良和抗逆新品种选育具有一定的理论和实际意义。

主权项

一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，其特征是包括如下步骤：（1）预培养：欧美杂种山杨在1/2MS培养基上继代繁殖得到组培苗；选取生长状态良好的组培苗上带有部分叶片的叶柄作为外植体，将所述外植体置于MS液体培养基中于22‑24℃、80‑100rpm暗培养1‑2d；（2）农杆菌的培养：①携带双元载体pMP90、pBI121的农杆菌C58在含有30mg/L庆大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上于28℃划线暗培养2‑3d；②挑单菌落接种到含有30mg/L庆大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的60‑75mlYEB液体培养基中于28℃、150‑200rpm暗培养24h，至OD600为0.6‑0.8；③将步骤②获得的菌液在3000‑4000rpm离心8‑10min，弃去上清液，用含有100μΜ乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬菌体至OD600为0.4‑0.5，于28℃、80‑100rpm继续培养0.5‑1h，得到侵染液；（3）共培养与芽的诱导：①将预培养后的外植体浸于侵染液中，于22‑24℃、80‑100rpm培养0.5‑2h，转移至含有100μΜ乙酰丁香酮的MS1固体培养基上，于22‑24℃黑暗共培养2d；②将共培养后的外植体用灭菌的300‑400mg/L头孢霉素水溶液清洗2‑3次，再置于含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的MS1固体培养基在22‑24℃，培养至长出不定芽，在第1‑7天，光照强度为400‑600lux，16h/d；在第8天开始，光照强度为1500‑2000lux，16h/d，每14d更换一次培养基；（4）芽的伸长：将带有不定芽的外植体转至含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的MS2固体培养基上诱导芽伸长至3‑5cm；（5）根的诱导：将伸长的芽转入含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上诱导生根。