[发明专利]一种在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法

摘要

一种在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法，涉及一种表达鸡堆型艾美耳球虫3-1E蛋白的方法。本发明是要解决目前乳酸乳球菌中无法表达鸡艾美耳球虫子孢子/裂殖子阶段表面抗原3-1E的问题。方法：将鸡堆型艾美耳球虫3-1E基因序列依照乳酸乳球菌的密码子偏好性进行优化，插入克隆载体并转化大肠杆菌感受态细胞，得阳性转化子；将阳性转化子和乳酸菌表达载体酶切后连接，构建重组表达载体；转化乳酸菌感受态细胞，鉴定；进行重组菌培养及诱导，即完成在乳酸乳球菌NZ9000中表达3-1E蛋白。本发明将密码子优化后的经人工合成的3-1E蛋白成功的在乳酸乳球菌中进行了表达。本发明方法用于球虫病的预防领域。

主权项

一种在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3‑1E蛋白的方法，其特征在于在乳酸乳球菌中表达鸡堆型艾美耳球虫3‑1E蛋白的方法，按以下步骤进行：一、将鸡堆型艾美耳球虫3‑1E基因序列依照乳酸乳球菌的密码子偏好性进行优化，得到人工合成的3‑1E基因，并在其5′端和3′端分别引入BamH 1和Xba 1的识别序列，之后与克隆载体pUC57连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子pUC57‑3‑1E；二、将pUC57‑3‑1E和大肠杆菌‑乳酸菌穿梭表达载体pTX8048分别经BamH 1和Xba 1双酶切后，分别回收3‑1E片段和载体片段，经T4DNA连接酶连接后构建重组表达载体pTX8048‑3‑1E；三、将pTX8048‑3‑1E经电转化入乳酸乳球菌NZ9000的感受态细胞中，经筛选得到含有重组质粒的阳性重组乳酸乳球菌NZ9000/pTX8048‑3‑1E，从阳性重组乳酸乳球菌中用质粒提取试剂盒提取质粒，之后针对步骤一中人工合成的3‑1E基因序列设计引物，分别进行PCR鉴定，酶切鉴定以及序列测定；四、将NZ9000/pTX8048‑3‑1E接种于含氯霉素的GM17液体培养基中，经30℃厌氧培养过夜后，以1∶50的体积比转接入含氯霉素的GM17液体培养基中进行扩增培养，30℃厌氧培养至OD600为0.4～0.6，之后用10ng/ml的乳链菌肽继续诱导培养3h，即完成了在乳酸乳球菌NZ9000中表达3‑1E蛋白。