[发明专利]一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群游离多糖含量的测定方法

摘要

本发明涉及一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群游离多糖含量的测定方法，属于生物技术领域。该方法在检品供试品的制备中进行蛋白酶K处理，加入的蛋白酶K量为酶解反应体系中蛋白的含量的2～8倍，还用冷酚处理即用乙酸钠饱和冷酚溶液分离结合物中结合多糖与游离多糖，与免疫电泳检测技术联合使用测得结合疫苗成品各群游离多糖的含量。本发明方法消除了各群结合物载体蛋白在免疫电泳中对电泳迁移率等相关因素的影响，有效地分离了结合物中结合多糖与游离多糖，建立了检测4个群以上脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群游离多糖的适宜检测体系，具有耐用性强、准确性及精密度高的特点，建立了评价4个群以上脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品质量的方法。

主权项

1.一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群游离多糖含量的测定方法，包括以下步骤：（1）检品供试品的制备①预处理：取待测的4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品用注射用水按标示量复溶，取5.0ml于超滤杯中，5000～10000×g离心超滤20～40min，收集浓缩液，补注射用水至总体积为1.0ml，得超滤浓缩液；用Lowry法测定该超滤浓缩液中蛋白的浓度；②蛋白酶K处理：酶解反应体系总体积为420μl，以所述的酶解反应体系总体积为基准，取1/6体积的超滤浓缩液，加入1/10体积的蛋白酶K缓冲液，蛋白酶K，加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的2～8倍，并补加注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育6小时±2小时，即得检品供试品原液JY；③冷酚处理：另取超滤浓缩液0.6ml，按超滤浓缩液与乙酸钠饱和冷酚溶液的体积比为1：2～3，加入乙酸钠饱和冷酚溶液，振荡混匀10～30 min，置冰浴5～20 min，8000～10000rpm，8℃离心10～30分钟，收取上清液，即得检品供试品上清液JS；（2）对照供试品的制备①预处理：取所述的4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品预测定群对应的多糖，用注射用水将该多糖稀释至多糖浓度为60μg/ml；②蛋白酶K处理：取步骤（2）①中60μg/ml的多糖溶液，按步骤（1）中②相同的方法处理，得对照供试品原液DY；③冷酚处理：将步骤（2）①中60μg/ml的多糖溶液用注射用水稀释至10μg/ml，取0.6ml，再按步骤（1）中③相同的方法处理，得对照供试品上清液DS；（3）抗血清琼脂糖胶板的制备称取琼脂糖，加入pH8.6的巴比妥电泳缓冲液使胶浓度为1.5%，加热溶胀完全，放56℃水浴10～30min，加入预测定群对应的效价为1：640的特异性抗血清，该抗血清的量为琼脂糖溶液体积的3%，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔；（4）上样待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂，然后在其余各孔依次分别加入预测定群对应的4个以上已知不同浓度的多糖标准品、JY、 DY、JS、DS ，加入量均为7μl/孔；（5）电泳及胶片处理按常规方法进行电泳、干胶制备、染色和脱色处理；（6）结果计算①用游标卡尺量取预测定群对应的各多糖标准品、JY、 DY、JS、DS的峰高值，以各浓度多糖标准品浓度对数为横坐标，对应峰高值为纵坐标作回归曲线，将JY、 DY、JS、DS的峰高值代入回归曲线分别计算JY、 DY、JS、DS的多糖含量；②根据如下公式计算有效性P：；③根据如下公式计算预测定群中游离多糖含量H：。