[发明专利]一种高偶联率高活性重金属全抗原的制备方法

摘要

一种高偶联率高活性重金属全抗原的制备方法，通过改良重金属全抗原的合成顺序，首先将过量的重金属离子与双功能螯合剂反应，反应完全后，用NaOH溶液调节pH，离心沉淀，去除过量的重金属离子，获得金属离子-螯合剂复合物，使之与生物大分子的反应能力减弱，然后将金属离子-螯合剂复合物与载体蛋白偶联，保证了所制备全抗原中蛋白的活性，制备了具有高偶联率、高活性的重金属全抗原。经小鼠免疫试验证明，所制备高偶联率、高活性的重金属抗原，其免疫原性好，方法重复性高，简单易行。

主权项

1.一种高偶联率高活性重金属全抗原的制备方法，其特征是：（1）配置浓度为0.1×10³mol/L~10.0×10^-3mol/L的双功能螯合剂[(R)-2-氨基-3-(4-氨基苯基)丙基]-（S-S）环己烷-1,2二乙基三胺五乙酸p-NH2-Bn-CHX-A”-DTPA溶液，向其中振荡滴加浓度为0.1mol/L~1.0mol/L的重金属盐溶液，要求加入的重金属离子与双功能螯合剂的物质的量之比n_重：n_螯＝1～10：1，每2-10s滴加一滴，得溶液A；重金属离子是Hg²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Cr²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺中的一种，重金属盐溶液是硝酸盐或盐酸盐；（2）将溶液A在10-35℃避光恒温反应8h～30h，反应完全后，用0.1mol/LNaOH溶液调节pH为7.0~10.0，3000r/min离心10min去沉淀,得溶液B；（3）配置浓度为1.0×10⁴mol/L~5.0×10^-4mol/L的载体蛋白溶液，向其中振荡滴加上述溶液B，要求加入的螯合剂与载体蛋白的物质的量之比n_螯：n_蛋白＝40～70：1，每2~10s滴加一滴；20分钟后再向反应液中加入偶联剂戊二醛，要求加入的偶联剂与螯合剂的物质的量之比n_偶：n_螯＝1~5：1，每2~10s滴加一滴；反应完全后，得溶液C；载体蛋白是牛血清白蛋白BSA、人血清白蛋白HAS、钥孔血蓝蛋白KLH、卵清蛋白OVA、甲状腺球蛋白BTG中的一种；（4）用0.1M，pH7.4的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液HBS或者羟乙基哌嗪乙磺酸HEPPS缓冲液，透析溶液C，时间为1～3天，得溶液D，即高偶联率高活性重金属全抗原。