[发明专利]一种木尔坦棉花曲叶病毒侵染性载体构建方法

摘要

本发明涉及一种木尔坦棉花曲叶病毒侵染性载体的构建方法。以木尔坦棉花曲叶病毒为材料对基因组DNAA和卫星DNAβ进行了侵染性克隆的构建，通过2种构建策略，将1.9个正向重复的基因组DNAA和1.8个正向重复的卫星DNAβ分别或者同时构建在具有高度复制能力的植物表达载体pCambia2300上，重组载体通过电击的方法导入农杆菌菌株，获得以农杆菌介导的对寄主植物具有高效侵染能力的病毒载体。本发明为研究病毒基因组结构与功能、寄主与病毒之间的互作、以及通过病毒诱导的基因沉默用以研究植物功能基因组提供了成熟的方法和体系。

主权项

一种木尔坦棉花曲叶病毒侵染性载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：1）从采集的感染木尔坦棉花曲叶病毒的棉花中提取植物基因组总DNA；2）以该植物基因组总DNA为模板，设计病毒全长特异引物GXA sal1 F：5’‑ GGTCGACGTCATCAATGACGTTGTA‑3和 GXA sal1 R：5’‑ACGTCGACCCGCATTTCCTCAAA‑3’对木尔坦棉花曲叶病毒的DNA A进行PCR扩增，扩增产物克隆至T‑Vector；同时，设计卫星DNAβ特异引物beta01：5'‑GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC‑3'和beta02：5'‑GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACAC‑3'对木尔坦棉花曲叶病毒的卫星DNAβ分子进行PCR扩增，扩增产物克隆至T‑Vector；3）对克隆产物进行阳性克隆的筛选并进行DNA序列测定；4）DNA序列测定结果通过DNAStar分析软件进行组合、拼接，获得木尔坦棉花曲叶病毒的DNA A组份和木尔坦棉花曲叶病毒的DNAβ的全长基因组序列；5）木尔坦棉花曲叶病毒侵染性载体构建：在测序结果基础上，利用分子生物学方法把木尔坦棉花曲叶病毒的DNA A组份的1.9个正向重复的基因组构建到改良型植物表达载体pCambia2300上，获得带有DNA A组份的重组植物表达载体pCambia‑1.9A, 并将其导入到大肠杆菌；利用限制性酶切的方法把1.8个正向重复的木尔坦棉花曲叶病毒的DNAβ构建到改良型植物表达载体pCambia2300上，获得带有DNAβ的重组植物表达载体pCambia‑1.8β, 并将其导入到大肠杆菌；或在测序结果基础上，利用分子生物学方法把木尔坦棉花曲叶病毒的DNA A组份的1.9个正向重复和木尔坦棉花曲叶病毒的卫星DNAβ的1.8个正向重复构建到同一个改良型植物表达载体pCambia2300上，获得带有木尔坦棉花曲叶病毒的DNA A和卫星DNAβ的重组植物表达载体pCambia‑1.9A‑1.8β, 并将其导入到大肠杆菌；6）通过电击的方法将上述重组植物表达载体pCambia‑1.9A、pCambia‑1.8β或pCambia‑1.9A‑1.8β分别导入农杆菌菌株EHA105；7）接种前的菌液处理：上述3种带有木尔坦棉花曲叶病毒重组植物表达载体的农杆菌分别接种20 mL YEP双抗液体培养基，28℃ 220rpm摇菌培养至OD600为0.8‑1.2；经12000 rpm 1分钟离心，弃上清，用含10 mM MgCl2，10 mM MES，200 mM 乙酰丁香酮的浸润缓冲液重新悬浮菌体，调整OD600为1.0左右，静置2‑3小时后浸润植物备用；8）浸润接种：选用4‑6叶充分展开的苗龄期的植株，利用不带针头的1 ml注射器在 3‑4周的植物叶片背面进行浸润一株植物一般接种3‑4片叶子；侵染性测定时； 9）接种植株置于25℃隔离温室培养，10天后观察接种植株的症状，对有症状和没有症状的接种植株进行PCR和Southern blot检测以鉴定其侵染性及病毒积累量。