[发明专利]用于修复石油污染土壤的微生物的固定化方法

摘要

本发明公开了一种用于修复石油污染土壤的微生物的固定化方法，它是选择秸秆为载体，在固定化时间为15h、固定化温度为30℃、转速为160r/min和载体量:菌量=1:4-7的最佳吸附条件下，将微生物吸附在秸秆材料载体上进行固定化，将固定有微生物的秸秆材料直接投加到被石油污染的土壤，不会引入二次污染，不需要回收，不涉及到重复利用的问题，对原油的降解率较游离菌提高近40％。本发明为废弃农作物的资源化利用提供一条有效的途径。

主权项

一种用于修复石油污染土壤的微生物的固定化方法，该方法是采用秸秆材料载体，在控制吸附时间、温度、转速、载体量的条件下，将微生物吸附在秸秆材料载体上进行固定化，其特征在于实施该法的具体骤如下：1)从受石油污染的土壤中筛选石油降解菌，得到一株降解率为23％的单菌SM‑3，该菌为杆状菌，测定该菌的生长曲线，该菌株的对数生长期为5‑16h，稳定期为16‑25h；2)以胜利原油为反应底物，测定该原油的标准曲线，用以计算降解率；3)选择秸秆材料为固定化载体，将秸秆材料粉碎，过80目筛；4)取粉碎后的秸秆材料按3％‑5％（V/V）压实后装入一定体积的反应釜中，用121℃高压水蒸汽灭菌20min，然后将用牛肉膏蛋白胨液体培养基活化16h后的密度为1×1010‑5×1010个/mL的菌液SM‑3按20％（V/V）接到反应釜中，于30～40℃恒温固定12～24h；固定化所用到的菌为SM‑3，将该菌用牛肉膏蛋白胨液体培养基培养至对数生长期和稳定期交界点（16h），其游离状态下对原油的降解率为23％；所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的配方为：NaCl 1％（m/m），蛋白胨1％（m/m），牛肉膏0.5％（m/m）和一定体积的蒸馏水混合均匀，以pH试纸为指示，用NaOH或盐酸调节调节pH7.0，121℃水蒸气灭菌20min；5)把固定了菌液的3％‑5％（V/V）载体连带未被固定的菌液一起转移到离心杯中，在1000r/min下离心10min，倒掉上层菌液，将下层载体无菌操作完全转移至事先准备好的原油培养基中，30℃恒温降解7d，降解率可达到60％，比游离菌提高近40％；所述原油培养基的配制方法是先在一定体积的反应釜中称取0.4％（m/m）左右的原油，记录准确质量，再量取20％（V/V）基础无机盐培养基至称好原油的反应釜中，本底油浓度约为10000mg/L；基础无机盐培养基的配方为NaCl 0.5（m/m），MgSO4·7H2O 0.025％（m/m），(NH4)2SO40.1％（m/m），NaNO30.2％（m/m），K2HPO4·3H2O1％（m/m），KH2PO40.4％（m/m）和一定体积的蒸馏水混合均匀，以pH试纸为指示，用NaOH或盐酸调节pH至7‑7.5，121℃水蒸气灭菌20min。