[发明专利]一种高密度检测拷贝数变异的方法

摘要

本发明涉及一种快速高密度多重竞争性PCR法检测拷贝数变异的方法，包括下列步骤：（1）提供多重竞争性PCR引物，由至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测区段和至少一对位于参照区段的嵌合特异引物组成；（2）用限制性内切酶消化样本获得独立的结构相似的样本模板小片段，使得该检测片段能被高密度PCR所检测，且对于高GC序列不敏感；（3）利用PCR法直接制备内对照模板；（4）多重竞争性PCR反应；和（5）数据分析。本发明的方法能在一天内快速简便地建立起中通量的适于5～28个基因/反应的拷贝数变异的检测方案，结果准确，适用性广。本发明还提供相应的试剂盒。

主权项

一种多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，包括以下步骤：（1）提供多重竞争性PCR引物，由至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测区段和至少一对位于参照区段的嵌合特异引物组成；所述通用荧光引物长度范围为10~25bp，5’端用荧光标记，TM值≤57℃值，且对待测基因组具有特异性；所述嵌合特异引物针对待测区段和参照区段设计，TM值≥62℃，长度范围为28~50bp，3’端为18~25bp的特异引物序列，5’端为所述通用引物序列，所述3’端和5’端的两个序列之间插入两个碱基的固定组合；所有嵌合特异引物之间的TM值的差异不超过3℃；当有两对或两对以上时，所述参照引物设计在不同的参照区段上，且与待测基因无特异性匹配；所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段之间有可检出的长度差异；（2）提供至少一对内对照的嵌合特异引物，针对待测区段或参照区段设计，其扩增产物比多重竞争性PCR产物中待测区段或参照区段所对应的产物长或短1~6bp，且由三部分组成：与（1）中所述的嵌合特异引物的3’端特异引物序列完全相同的5’端多重PCR引物区；与（1）中所述的嵌合特异引物下游18~25bp的序列相同，并且TM值≥62℃、引物间TM值的差异不超过3℃的3’端序列；所述5’端多重PCR引物区和所述3’端序列之间是‑3~3bp的长度调节序列，即在5’端和3’端两序列间分别插入1~3bp任意碱基、或在5’和3’端序列间的靠3’端分别删除1~3bp碱基，使所述的内对照的嵌合特异引物的扩增产物即内对照比多重竞争性PCR产物中待测区段或参照区段所对应的产物长或短1‑6bp；（3）用所述内对照的嵌合特异引物对待测区段或参照区段模板进行PCR扩增制备内对照稀释液，将PCR产物DNA定量、稀释，直接作为内对照模板使用；（4）用一至五种限制性内切酶对目标区段进行消化；（5）多重竞争性PCR反应：(a)将含待测区段和参照区段的待测样本和对照样本与内对照稀释液及多重竞争性PCR反应试剂混合在一起，进行PCR，在前3~16个循环中，退火温度高于所述通用荧光引物的退火温度，用于所述嵌合特异引物引导的扩增，在后17~20个循环中，退火温度低于所述通用荧光引物的退火温度，用于所述通用引物引导的扩增，且两组退火温度的差距≥5℃；(b)根据荧光标记PCR扩增产物长度不同，对扩增产物片段进行检测，获得待测样本中待测区段和参照区段以及内对照扩增产物片段的长度信息与相应的荧光 强度信息；（6）数据分析：i.计算每个待测区段和参照区段的样本峰高和/或峰面积（S）和相应内对照的峰高和/或峰面积（I），得到每个待测区段和参照区段的比值（S/I）；ii以一个参照区段的比值为标准，将所有待测区段和参照区段的比值同其作比，进行数据内部标化；iii.按照i和ii的步骤将对照样本进行数据内部标化；iv.将待测样本和对照样本的内部标化值作比，获得待测样本与对照样本的比值，该比值乘以对照样本的拷贝数，得到待测样本的拷贝数。