[发明专利]壳聚糖-5’ppp-NS1shRNA纳米复合物的制备方法

摘要

本发明属于纳米分子的合成及基因工程技术领域，具体涉及到壳聚糖-NS1shRNA纳米复合物的制备方法。把壳聚糖纳米颗粒、NS1shRNA按一定的比例混合，通过静电的作用形成壳聚糖-NS1shRNA纳米复合物，利用壳聚糖作为载体把病毒的NS1基因、shRNA导入哺乳动物细胞中，和宿主细胞的模式识别受体RIG-I样受体(RIG-I likereceptors,RLRs)结合，能结合shRNA并激活下游的信号级联反应,激活天然免疫系统和乳细胞内抗病毒的干扰素通路，诱导I型干扰素的产生，最终清除感染体内的病毒。本发明使用壳聚糖作为基因药物的生物体外及生物体内给药系统，取得了很好的效果，能应用于shRNA的体内外转染。

主权项

壳聚糖‑5’ppp ‑NSshRNA纳米复合物的制备方法，其特征是：第一步 壳聚糖纳米颗粒的制备：1）、微乳液A的合成：22 mL环己烷；8 mL己醇；200 μL 壳聚糖；400 μL壳聚糖‑ Rh；2.6 mL Triton X100 混合，搅拌，直到得到溶液清晰，得到微乳液A；2）、微乳液B的合成：在离心管中放入MW 为 150.09的100 μL NHS ()；MW 为 115.09的200 μL酒石酸；MW 为 190的300 μL EDC离心使溶液应该达到0.2M，静止20分钟，然后把全部溶液放到微乳液A中去，搅拌过夜，至少16小时，得到微乳液B；3）、在上述微乳液B中溶液中加入1 mL的乙醇溶液，8,000 rpm离心，去上清然后添加1mL的乙醇， 8000 rpm，再离心，再重复以上步骤两次，获得的壳聚糖纳米颗粒在1 ‑ 2 mL HPLC级水中再溶解，在去离子水中透析的1 ‑ 2天 ，每天换水；第二步 病毒外膜蛋白NS1基因的获得和5’ppp‑ NS1shRNA的合成：病毒的NS基因890 bp编码非结蛋白NS1、NS2，每个节段的两端具有末端重复序列，所有节段的3 端核苷酸序列相同，根据NCBI 登录的流感病毒A/PR/8/1934(H1N1)株的NS1基因，选取其中19个碱基，委托鼎国生物公司合成19个核苷酸的NS1shRNA,加了5’ppp 的帽状结构，碱基序列为：5’ppp‑TGAGGATGTCAAAAATGCA；第三步 壳聚糖‑5’ppp ‑ NS1shRNA纳米复合物的合成：把壳聚糖纳米颗粒、5’ppp NS1 shRNA的水溶液按质量比的1：5比例混合，形成壳聚糖‑5’ppp ‑ NS1shRNA纳米复合物，用5%凝胶电泳检测壳聚糖与5’ppp NS1shRNA的结合情况。