[发明专利]甘蔗愈伤组织原生质体的分离与纯化方法

摘要

本发明涉及一种甘蔗愈伤组织原生质体的分离与纯化方法，包括甘蔗愈伤组织培养、甘蔗悬浮细胞培养、甘蔗原生质体的分离和甘蔗原生质体的纯化。利用本发明的方法可以快速从甘蔗胚性愈伤组织培养获得悬浮细胞系，并通过酶消解后分离纯化获得质量高、数量足、均一性好的完整原生质体，为甘蔗外源基因表达、启动子分析、基因沉默等转基因瞬时表达研究提供理想的实验材料。

主权项

一种甘蔗愈伤组织原生质体的分离与纯化方法，包括甘蔗愈伤组织培养、甘蔗悬浮细胞培养、甘蔗原生质体的分离和甘蔗原生质体的纯化；其特征在于操作步骤如下：(1) 甘蔗愈伤组织培养取消毒后的甘蔗心叶组织，无菌条件下切成1‑2 cm厚的薄片，在MS3固体培养基上，28 ℃暗培养1‑2个月，每隔2周继代1次；所述MS3固体培养基为：MS+0.5 g/L水解酪蛋白+3 mg/L 2,4‑D+30 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂粉；MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；(2) 甘蔗悬浮细胞培养将甘蔗胚性愈伤组织捣碎后，在MS3液体培养基中，28℃暗培养2周，纱布过滤，滤液静置10‑15 min，吸取底部胚性愈伤组织培养液，于恒温摇床震荡培养，转速120转/秒，28 ℃暗培养1‑2月，每隔1周继代1次，直至悬浮细胞系出现；所述MS3液体培养基：MS+0.5 g/L水解酪蛋白+3 mg/L 2,4‑D+30 g/L蔗糖，去离子水补足1升；    (3) 甘蔗原生质体的分离    取步骤（2）的新鲜悬浮细胞分装到50 mL离心管，100 g离心2 min；弃上清液，用酶解缓冲液清洗悬浮细胞后，100 g离心2 min；弃上清液，取悬浮细胞2‑3 g加入6孔的细胞培养板内，用3 mL酶解反应液酶解过夜，分离出甘蔗愈伤组织原生质体；所述酶解缓冲液：0.02 mol/L MES+0.4 mol/L甘露醇+0.02 mol/L氯化钾，pH 5.7；所述酶解反应液：2 %纤维素酶+0.1 %果胶酶+0.01 mol/L氯化钙+0.1 %牛血清蛋白，溶解于酶解缓冲液；在酶解反应液中，各原料所占的百分比为各原料与酶解缓冲液的重量百分比；    (4) 甘蔗原生质体的纯化    用无菌水清洗70μm孔径的尼龙网，然后用W5溶液润洗，取步骤（3）获得的原生质体转移至10 mL离心管中，100 g离心2 min；弃上清液，冰浴的W5溶液悬浮原生质体，100 g离心1 min；弃上清液后即为纯化的甘蔗愈伤组织原生质体；所述W5溶液：2 mmol/L MES+154 mmol/L 氯化纳+125 mmol/L 氯化钙+5 mmol/L 氯化钾，pH 5.7。