[发明专利]甘蔗赤条病菌巢式PCR检测方法

摘要

本发明涉及一种甘蔗赤条病菌（Acidovoraxavenaesubsp.avenae）的巢式PCR检测方法，以感病的甘蔗叶片DNA为模板，根据甘蔗赤条病菌的16SrRNA核苷酸序列设计的特异性引物SRSD-16S-F1和SRSD-R2、SRSDF1和SRSDR1，采用巢式PCR扩增方法，检测甘蔗赤条病菌。本发明的甘蔗赤条病菌巢式PCR检测方法，克服了生物学鉴定、电镜技术、酶联免疫技术、常规PCR等方法的缺点，提供了一种快速、特异、灵敏的甘蔗赤条病菌的检测方法。

主权项

一种甘蔗赤条病菌巢式PCR检测方法，包括甘蔗叶片DNA提取、引物设计、第1轮PCR扩增、第2轮PCR扩增和电泳检测；其特征在于：（1）引物设计：扩增甘蔗赤条病菌（Acidovorax avenae subsp. avenae）的引物SRSD‑16S‑F1和SRSD‑R2、SRSD‑F1和SRSD‑R1的序列如下：  SRSD‑16S‑F1：5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’  SRSD‑R2：5’‑TGTCAAAGGTGGGTAAGGTT‑3’；SRSD‑F1：5’‑ACGGTAACAGGTCTTCGGA‑3’SRSD‑R1：5’‑CAGTTGACATCGTTTAGGGC‑3’；    （2）第1轮PCR扩增：PCR扩增体系为总体积50 μL，内含5.0 μL 10×PCR 缓冲液，4.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，10 μmol/L引物SRSD‑16S‑F1和SRSD‑R2各2.0 μL，0.25 U Taq DNA Polymerase，500 ng甘蔗叶片基因组DNA，ddH2O补足到50 μL； PCR扩增程序如下：94 ℃预变性3 min、94 ℃变性45 S、55~60 ℃退火30 S、72 ℃延伸60 S，共30~35个循环，最后72 ℃再延伸7 min；所述10×PCR缓冲液组成成分为500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris‑HCl (pH 8.3)，15 mmol/L MgCl2；    （3）第2轮PCR扩增： PCR扩增体系为总体积50 μL，内含5.0 μL 10×PCR 缓冲液，4.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，10μmol/L引物SRSD‑F1和SRSD‑R1各2.0 μL，0.25 U Taq DNA Polymerase，第一轮PCR产物稀释100倍后取1.0 μL，ddH2O补足到50 μL；PCR扩增程序如下：94 ℃预变性3 min、94 ℃变性45 S、53~57 ℃退火30 S、72 ℃延伸45 S，共30~35个循环，最后72 ℃再延伸7 min；    （4）电泳检测：出现一条分子量为755 bp的核酸带的样品，为感染甘蔗赤条病菌的植株叶片样品。