[发明专利]一种荧光检测DNA残留量实验中DNA提取方法

摘要

本发明涉及一种荧光检测DNA残留量实验中DNA提取方法，其特点是：(1)磁珠法提取样品中残留DNA提取，A消化蛋白酶反应，B磁珠绑定DNA，C清洗DNA，D稀释样品DNA；(2)酚—异丙醇法提取DNA；(3)picogreen检验。本发明采用磁珠提取，代替传统的酚氯仿法提取疫苗中的残留DNA，并用PicoGreen试验验证此磁珠提取技术可以降低了污染物质，如酚 异丙醇、氯化钠等，对荧光信号的影响，从而得到相对准确的检验结果。

主权项

一种荧光检测DNA残留量实验中DNA提取方法，其特征在于有以下步骤：(1)磁珠法提取样品中残留DNA提取A、消化蛋白酶反应在1.5ml离心管中加入样品100μl，加入0.2％蛋白酶K溶液20μl，加入蛋白酶K缓冲液200μl，56℃培养30min，培养后每管加肝素40μg、2μg tRNA；B、磁珠绑定DNA将磁珠重悬、震荡混匀后，每管加15μl磁珠；再加入200μl无水乙醇、倒转2次、漩涡混匀5min、spin15s、磁力架静止5min，吸除悬浮液体；C、清洗DNA1)从磁力架取下，加500μl缓冲液(如磁珠贴管壁，应缓慢冲洗)、倒转2次、漩涡混合5s；2)spin 15s；在磁力架静止1min；吸出悬浮液体(不要接触磁珠)；3)从磁力架取下，加500μl洗液(如磁珠贴管壁，应缓慢冲洗)、倒转2次、漩涡混合5s；4)spin 15s、磁力架静止1min吸出悬浮液体(不要接触磁珠)；5)从磁力架取下，加500μl洗液(如磁珠贴管壁，应缓慢冲洗)、倒转2次、漩涡混合5s；6)spin 15s、磁力架静止1min；吸出悬浮液体(不要接触磁珠)；7)空气干燥5min(去除残留乙醇干扰)；D、稀释样品DNA1)每管加100μl TE洗脱液(吸头反复吹打)；2)高速漩涡混合10s、培养70℃、7min，在此期间混合2‑3次，有助于悬浮；3)spin15s、磁力架静止2min、将含有DNA的洗脱液全部转移至新管，用于检测；(2)酚‑异丙醇法提取DNA在1.5ml离心管中加入样品100μl；加入2％蛋白酶K溶液1微升；加入蛋白酶K缓冲液12μl；37℃培养4小时Spin后，上述样品管加入等体积的Tris饱和酚，混合30秒，冰浴中放置5min，15000g离心10min；小心移取上层液体至新管中，每管加入3mol/L乙酸钠溶液60μl，再加入600μl预冷异丙醇，颠倒混合，‑20℃过夜；15000g离心15min，弃去上清；加入500μl 75％冰冷乙醇洗涤沉淀，15000g离心15min，弃去上清；沉淀在热蒸干器中干燥，直至管内液体全部蒸后，加100μl TE缓冲液溶解DNA；(3)picogreen检验1)使用前恢复室温，染料用TE缓冲液200倍稀释；使用塑料容器；需避光，防止染料见光分解；制备后0.5小时内使用；2)将稀释后的标准品与样品与等体积的染料混合，每孔中加入200微升。测定各孔荧光值。