[发明专利]利用阴离子交换层析去除乙脑疫苗制品中残留DNA的方法

摘要

本发明涉及一种利用阴离子交换层析去除乙脑疫苗制品中残留DNA的方法，其特点是将乙脑疫苗浓缩液凝胶过滤层析所获得的初步纯化液进行阴离子交换层析，使DNA牢固吸附在离子交换介质上而乙脑病毒蛋白直接穿透，从而达到去除宿主DNA的目的。本发明针对现有的浓缩、凝胶过滤层析等提取乙脑疫苗方法只能将一定比例的游离DNA去除，不能去除与抗原蛋白结合的宿主DNA；临床不良反应现象屡见不鲜的问题，在保证疫苗效价的前提下，提高疫苗产品质量，去除大量杂蛋白及宿主DNA，使疫苗制品中残留DNA含量达到50pg/剂以下，解决目前乙脑疫苗行业面临的质量问题。

主权项

一种利用阴离子交换层析去除乙脑疫苗制品中残留ＤＮＡ的方法，其特征在于：使用AKTApilot自动层析设备将2000mL乙脑疫苗浓缩液经过BPG200层析柱，Sepharose 4 Fast Flow凝胶过滤层析，紫外检测波长280nm，流速为6cm/h，流动相为pH7.2，NaCl为0.2mol/L的10mmol/L PBS，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白初步纯化液;再用pH7.2，NaCl 0.2mol/L的10mmol/L PBS平衡DEAE Sepharose Fast Flow层析柱，柱床体积1000mL，至紫外、电导平衡，流速3cm/h;然后将初步纯化液按2倍柱床体积，即2000mL，加载到DEAE Sepharose Fast Flow层析介质中，流速为2cm/h，宿主ＤＮＡ牢固吸附在DEAE Sepharose Fast Flow层析介质上，而乙脑病毒蛋白与离子交换介质的结合位点被缓冲液中的离子取代，直接穿透，紫外检测波长280nm，收集吸收峰，当样品全部加载后，继续用pH7.2，NaCl 0.2mol/L的10mmol/L PBS缓冲液洗涤离子柱2000mL，即2倍柱床体积，直到紫外吸收值降到基线，收集的穿透峰为最终纯化液;收集结束后，用1mol/L NaCl冲洗离子柱3000mL ，即3柱床体积，进行再生处理，流速3cm/h；或使用AKTApilot自动层析设备将2000mL乙脑疫苗浓缩液经过BPG200层析柱，Sepharose 4 Fast Flow凝胶过滤层析，紫外检测波长280nm，流速为6cm/h，流动相为pH7.4，NaCl 0.3mol/L的10mmol/L PBS，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白初步纯化液;再用pH7.4，NaCl 0.3mol/L的10mmol/L PBS平衡Q Sepharose Fast Flow层析柱至紫外、电导平衡，流速3cm/h;然后将初步纯化液按2倍柱床体积，即2000mL，加载到Q Sepharose Fast Flow层析介质中，流速为2cm/h，宿主ＤＮＡ牢固吸附在Q Sepharose Fast Flow层析介质上，而乙脑病毒蛋白与离子交换介质的结合位点被缓冲液中的离子取代，直接穿透，紫外检测波长280nm，收集吸收峰；当样品全部加载后，继续用pH7.4，NaCl 0.3mol/L，的10mmol/L PBS缓冲液洗涤离子柱2000mL即2倍柱床体积，直到紫外吸收值降到基线，收集的穿透峰为最终纯化液;收集结束后，用1mol/L NaCl冲洗离子柱3000mL 即3柱床体积，进行再生处理，流速3cm/h；或使用AKTApilot自动层析设备将2000mL乙脑疫苗浓缩液经过BPG200层析柱，Sepharose 4 Fast Flow凝胶过滤层析，紫外检测波长280nm，流速为6cm/h，流动相为pH7.4，NaCl 0.4mol/L的10mmol/L PBS，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白初步纯化液;再用pH7.4，NaCl 0.4mol/L的10mmol/L PBS平衡Capto Q层析柱至紫外、电导平衡，流速3cm/h;然后将初步纯化液按2倍柱床体积，即2000mL，加载到Capto Q层析介质中，流速为2cm/h，宿主ＤＮＡ牢固吸附在Capto Q层析介质上，而乙脑病毒蛋白与离子交换介质的结合位点被缓冲液中的离子取代，直接穿透，紫外检测波长280nm，收集吸收峰，当样品全部加载后，继续用pH7.4，NaCl 0.4mol/L的10mmol/L PBS缓冲液洗涤离子柱2000mL，即2倍柱床体积，直到紫外吸收值降到基线，收集的穿透峰为最终纯化液;收集结束后，用1mol/L NaCl冲洗离子柱3000mL ，即3柱床体积进行再生处理，流速3cm/h；或使用AKTApilot自动层析设备将2000mL乙脑疫苗浓缩液经过BPG200层析柱，Sepharose 6 Fast Flow凝胶过滤层析，紫外检测波长280nm，流速为6cm/h，流动相为pH7.6，NaCl 0.4mol/L的10mmol/L PBS，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白初步纯化液;再用pH7.6，NaCl 0.5mol/L的10mmol/L PBS平衡Q Sepharose Fast Flow层析柱至紫外、电导平衡，流速3cm/h;然后将初步纯化液按2倍柱床体积，即2000mL，加载到Q Sepharose Fast Flow层析介质中，流速为2cm/h，宿主ＤＮＡ牢固吸附在Q Sepharose Fast Flow层析介质上，而乙脑病毒蛋白与离子交换介质的结合位点被缓冲液中的离子取代，直接穿透，紫外检测波长280nm，收集吸收峰，当样品全部加载后，继续用pH7.6，NaCl 0.5mol/L的10mmol/L PBS缓冲液洗涤离子柱2000mL，即2倍柱床体积，直到紫外吸收值降到基线，收集的穿透峰为最终纯化液;收集结束后，用1mol/L NaCl冲洗离子柱3000mL，即3柱床体积，进行再生处理，流速3cm/h；或使用AKTApilot自动层析设备将2000mL乙脑疫苗浓缩液经过BPG200层析柱，Sepharose 6 Fast Flow凝胶过滤层析，紫外检测波长280nm，流速为6cm/h，流动相为pH7.8，NaCl 0.6mol/L的10mmol/L PBS，收集第一个吸收峰，即乙脑病毒蛋白初步纯化液;再用pH7.8NaCl 0.6mol/L的10mmol/L PBS平衡Capto Q层析柱至紫外、电导平衡，流速3cm/h;然后将初步纯化液按2倍柱床体积，即2000mL，加载到Capto Q层析介质中，流速为2cm/h，宿主ＤＮＡ牢固吸附在Capto Q层析介质上，而乙脑病毒蛋白与离子交换介质的结合位点被缓冲液中的离子取代，直接穿透，紫外检测波长280nm，收集吸收峰，当样品全部加载后，继续用pH7.8，NaCl 0.6mol/L的10mmol/L PBS缓冲液洗涤离子柱2000mL，即2倍柱床体积，直到紫外吸收值降到基线，收集的穿透峰为最终纯化液;收集结束后，用1mol/L NaCl冲洗离子柱3000mL，即3柱床体积，进行再生处理，流速3cm/h。