[发明专利]一种测定赭曲霉毒素A的适配体传感器的构建方法

摘要

一种测定赭曲霉毒素A的适配体传感器的构建方法，属于生物传感器检测技术领域。本发明包括：链霉亲和素包被PCR管，适配体与其部分互补的DNA片段杂交并固定在PCR管表面，适配体传感器的构建。本发明提供了一种与赭曲霉毒素A高特异性高亲和力结合的单链DNA适配体和部分互补于适配体的DNA片段，通过适配体与赭曲霉毒素A的识别结合，诱导适配体构象的改变从而导致互补于适配体的DNA片段释放，以互补于适配体的片段作为PCR扩增模板，通过扩增后的荧光信号对赭曲霉毒素A进行检测。本发明方法能实现对赭曲霉毒素A超灵敏检测，检测限低、检测灵敏度高、特异性好，为痕量赭曲霉毒素A以及其他有害物质的检测提供了一种有效的方法。

主权项

一种测定赭曲霉毒素A的适配体传感器的构建方法，其特征在于包括：链霉亲和素包被PCR管，适配体与其部分互补的DNA片段杂交并固定在PCR管表面，适配体传感器的构建；具体步骤为：（1）链霉亲和素包被PCR管首先将PCR管用50μL质量浓度0.8%的戊二醛溶液在37℃包被5h，然后用超纯水将PCR管洗涤三次，每次3min；再用pH7.2、0.01M的碳酸盐缓冲液稀释的12.5ng/mL的链霉亲和素包被PCR管，每管30μL在37℃孵育2h，孵育结束后再用上述碳酸盐缓冲液洗涤三次，每次3min，以去除未结合的链霉亲和素；（2）适配体与其部分互补的DNA片段杂交并固定在PCR管表面用含750mM NaCl、75 mM C6H5Na3O7、pH 8.0杂交缓冲液将适配体和部分互补于适配体的DNA片段分别稀释到50nM和100nM，并将两者以1:1的体积比充分混合，将混合液于每个PCR管加入30μL，并在37℃条件下孵育40min，以使互补双链充分杂交并结合到PCR管表面；所述单链DNA适配体片段和部分互补于适配体的DNA片段序列分别为：适配体: 5’‑GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGG‑biotin‑3’，与适配体部分互补的DNA片段: 5’‑CCCACACCCG ATCGGGAAAA TGCAAGAAGA AGTCATTAGT CCTAGACAAC GTTACTATAA CGTGAATGTA ATGAACCTAC AAGACCTTCC AGATTTTTCG GC‑3’；（3）适配体传感器的构建在步骤（2）包被好的每个PCR管中，分别加入30μL 5×10‑6ng/g～5 ng/g的十倍梯度稀释的赭曲霉毒素A标准品，在45℃孵育40min，使赭曲霉毒素A和适配体充分结合，结合缓冲液为含10 mM Tris、120 mM NaCl、5 mM KCl、20 mM CaCl2、pH 7.0的缓冲液，反应结束后，再用结合缓冲液洗涤三次，每次3min，最后将PCR管拍打干净，以去除未结合的赭曲霉毒素A和双链变性释放出的部分互补于适配体的DNA片段；每个PCR管在30μL的体系中进行反应，此体系由以下反应物质组成：各0.6μL终浓度均为2μM的上游引物和下游引物，1.8μL 20×EvaGreen染料，3μL终浓度为1mM的dNTP混合液，3μL 10×PCR缓冲液，0.3μL浓度为5U的Taq DNA聚合酶和超纯水补足30μL；将反应物充分混匀，最后用荧光定量PCR仪CFX‑96进行测定，扩增条件为：首先95℃预变性30s；然后95℃变性5s、57℃退火和延伸30s,总共为39个循环；得到互补于适配体的DNA片段的扩增曲线；再从65℃升温至95℃，每0.5℃读取一次荧光值，使得扩增后的双链DNA变性，得到DNA熔解曲线；上游引物：5’‑GGGAAAATGC AAGAAGAAGT CAT‑3’，下游引物：5’‑GCCGAAAAAT CTGGAAGGTC‑3’。