[发明专利]植物组织快速石蜡制片的方法

摘要

本发明公开了一种植物组织快速石蜡制片的方法，其步骤包括：取样、固定、脱水及透明、石蜡渗透、包埋及切片、黏片和展片、染色和封固。本发明极大地提高了植物组织石蜡制片固定的效率，较传统石蜡制片需要一天的固定时间提高效率10～20倍；用叔丁醇或正丁醇作为脱水、透明剂简化了脱水与透明步骤，所需脱水及透明时间仅为6～7h，较传统脱水和透明效率提高了3倍以上；提高了植物组织在石蜡渗透的效率和包埋的质量，渗蜡时间共需4～7h，较传统渗蜡方法效率提高1倍以上，有效地解决了渗蜡时温度过高造成组织变硬和变脆等问题。本发明具有实验程序简化、所用仪器设备价格便宜、制片周期短、制片质量高和安全环保等特点。

主权项

一种植物组织快速石蜡制片的方法，其步骤如下：（1）固定 将植物组织材料小块放入装有FAA固定液的玻璃瓶中，确保材料完全浸没在固定液中，然后将该玻璃瓶放入真空干燥箱中，设定35～40℃,﹣0.07～﹣0.08Mpa，干燥60～90min，迅速杀死组织并排出组织材料中的气体直至沉入瓶底； （2）脱水及透明  将（1）处理过的玻璃瓶中的FAA固定液倒出，换成50%的乙醇，将装试验材料的玻璃瓶放入真空干燥箱中干燥，真空干燥箱条件为：35～40℃，﹣0.07～﹣0.08Mpa，干燥20～30min；再将玻璃瓶中50%的乙醇换成60%的乙醇，将玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥条件同上，把60%的乙醇换成70%的乙醇，把玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥条件同上，然后将玻璃瓶中70%的乙醇换成脱水—透明剂Ⅰ液，将玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥条件为：35～40℃，﹣0.07～﹣0.08Mpa，干燥40～60min；再将脱水—透明剂Ⅰ液换成脱水—透明剂Ⅱ液，将玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥条件同上，再把脱水—透明剂Ⅱ液换成脱水—透明剂Ⅲ液，把玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥条件同上；最后将脱水—透明剂Ⅲ液换成纯叔丁醇或正丁醇，将玻璃瓶放入真空干燥箱干燥，真空干燥条件为：40～45℃，﹣0.07～﹣0.08Mpa，干燥60～120min，使植物组织细胞中的水分和乙醇逐渐被纯叔丁醇或正丁醇所替代，完成脱水和透明；（3）石蜡渗透  将经（2）处理的植物组织材料脱水剂换成叔丁醇—石蜡Ⅰ液或正丁醇—石蜡Ⅰ液，将装试验材料的玻璃瓶放入真空干燥箱进行石蜡渗透，石蜡渗透条件为：52～58℃，﹣0.07～﹣0.08Mpa，渗透处理60～120min；然后将叔丁醇—石蜡Ⅰ液或正丁醇—石蜡Ⅰ液换成叔丁醇—石蜡Ⅱ液或正丁醇—石蜡Ⅱ液，继续石蜡渗透，石蜡渗透条件同上；最后将叔丁醇—石蜡Ⅱ液或正丁醇—石蜡Ⅱ液换成纯石蜡液，进一步纯石蜡渗透，石蜡渗透条件同上，使植物组织细胞中的叔丁醇或正丁醇逐渐被纯石蜡所替换；（4）包埋及切片  将经（3）处理的植物组织与纯石蜡溶液一起倒入包埋盒，调整好植物组织的位置，使植物组织与纯石蜡溶液快速冷却，直至石蜡由溶液凝固成石蜡块，将包埋好的石蜡块经过分割、修整与固着，然后经切片机将石蜡块切成连续的蜡带，蜡带形状为长方形，上下两个长边平行，切片厚度为4～12µm；（5）黏片和展片  将（4）切好的蜡带分割成适宜的片段，用明胶黏贴剂贴于载玻片上，黏片时将蜡片完全伸展，故黏片和展片是在载玻片上连续完成的，将黏贴好蜡带的载玻片水平放入真空干燥箱进行烤片，烤片的条件为：30～33℃，﹣0.07～﹣0.08Mpa，烤片30~40min，之后等待其温度降至室温备用；（6）染色  采用番红—固绿双重染色法染色，其顺序为：A、将经（5）处理的粘有蜡片的载玻片放入纯二甲苯中10～15min，使石蜡完全溶解；B、将A处理过的植物组织载玻片转到二甲苯—纯乙醇混合液Ⅰ中过渡处理2～3min；C、将B处理过的植物组织载玻片转到二甲苯—纯乙醇混合液Ⅱ中过渡处理2～3min；     D、将C处理过的植物组织载玻片在纯乙醇中脱水处理30～60s，再依次转到95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、60%乙醇中分别脱水、透明处理2～3min；     E、将D处理过的植物组织载玻片置入含1%番红染料的60%乙醇溶液的卧式染缸中，然后把染缸放入真空干燥箱，真空干燥条件为：38～42℃，染色 3～5h；F、将经E染色的植物组织载玻片依次转入60%、70%、80%、90%和95%的乙醇中分别脱水、透明处理30～40s；G、将经F处理的植物组织载玻片置入含1%固绿染料的95%乙醇溶液染缸中，染色45～60s；H、将G处理过的植物组织载玻片再依次经95%乙醇、无水乙醇、二甲苯—纯乙醇混合液Ⅱ液、二甲苯—纯乙醇混合液Ⅰ液中分别处理5～10s，最后置于纯二甲苯中脱水、透明10～15s；（7）封固  用二甲苯稀释的加拿大树胶做为封固剂，对经（6）处理的植物组织载玻片进行封固，将封片在室温下自然干燥即可。