[发明专利]动脉粥样硬化疫苗

摘要

本发明提供一种动脉粥样硬化疫苗，包括T7噬菌体以及人类胆固醇酯转运蛋白CETP，其特征在于将人类胆固醇酯转运蛋白CETP的编码核酸序列插入T7噬菌体的衣壳蛋白10B的C端，使人类胆固醇酯转运蛋白CETP展示于T7噬菌体的表面，从而构建出动脉粥样硬化疫苗。该疫苗接种后，能够有效降低血浆中的胆固醇水平，达到预防动脉粥样硬化的目的，并且具有安全无毒，遗传稳定性好等特点。

主权项

一种动脉粥样硬化疫苗，包括T7噬菌体以及人类胆固醇酯转运蛋白CETP，其特征在于将人类胆固醇酯转运蛋白CETP的编码核酸序列插入T7噬菌体的衣壳蛋白10B的C端，使人类胆固醇酯转运蛋白CETP展示于T7噬菌体的表面，从而构建出动脉粥样硬化疫苗；具体步骤如下：A、 动脉粥样硬化疫苗重组噬菌体的构建：由商业公司合成人类胆固醇酯转运蛋白CETP编码DNA序列在pGEM‑T载体上，DNA序列的5’端含限制性内切酶EcoRI的酶切位点，3’端含限制性内切酶Hind III的酶切位点；用限制性内切酶EcoRI和Hind III处理pGEM‑T载体，得到含有EcoRI和Hind III粘性末端的人类胆固醇酯转运蛋白CETP编码DNA序列，用市售小量胶回收试剂盒回收该片段；用限制性内切酶EcoRI和Hind III处理T7噬菌体载体T7 select 10‑3b，用市售小量胶回收试剂盒回收经限制性内切酶EcoRI和Hind III处理的T7噬菌体载体T7 select 10‑3b大片段；用T4连接酶体系将含有EcoRI和Hind III粘性末端的人类胆固醇酯转运蛋白CETP编码DNA序列与经限制性内切酶EcoRI和Hind III处理的T7噬菌体载体T7 select 10‑3b大片段连接，即将含有EcoRI和Hind III粘性末端的人类胆固醇酯转运蛋白CETP编码DNA序列插入T7 select 10‑3b的克隆位点EcoRI和Hind III之间，该插入点正好位于T7噬菌体10B基因的3’端；将连接所得的重组噬菌体核酸，用T7噬菌体包装试剂盒T7 Select Packaging Kit包装为完整噬菌体；按每100μL包装反应物与250μL菌液的量，将包装反应物接种于用LB培养基37℃新鲜培养的OD600为1.0的BLT5403菌液上混匀后，迅速与5mL融化后42℃温浴的上层琼脂混合均匀，并铺氨苄抗性LB琼脂培养平板，37℃倒置培养至形成噬菌斑；其中：所用LB培养基配法如下：细菌培养用胰化蛋白胨10g，细菌培养用酵母提取物5g，NaCl 5g，溶于900mL注射用水中，用1mol/L的NaOH调节pH至7.5，再定容至1000mL，1.034×105Pa高压蒸汽灭菌20min；所用上层琼脂配法如下：细菌培养用胰化蛋白胨10 g，细菌培养用酵母提取物5 g，NaCl 5 g，琼脂 6 g，加入注射用水900mL，用1mol/L的NaOH调节pH至7.5，1.034×105Pa高压下蒸汽灭菌20min后，分装成5mL每支，4℃存放备用；所用氨苄抗性LB琼脂培养平板制法如下：细菌培养用胰化蛋白胨10g，细菌培养用酵母提取物5g，NaCl 5g，细菌培养用琼脂15g，加入注射用水900mL，用1mol/L的NaOH调节pH至7.5，再定容至1000mL，1.034×105Pa高压蒸汽灭菌20min，冷却至50℃以下加入氨苄青霉素，混匀后铺平板；B、动脉粥样硬化疫苗重组噬菌体的筛选、鉴定：从步骤A所得长有噬菌斑的平板挑取单个噬菌斑，用PCR方法和测序方法综合鉴定筛选出含人类胆固醇酯转运蛋白CETP编码基因的阳性噬菌体克隆得到含人类胆固醇酯转运蛋白CETP编码基因的重组噬菌体，作为动脉粥样硬化疫苗种子；C 、动脉粥样硬化疫苗原液的制备：将步骤B所得单克隆化的含人类胆固醇酯转运蛋白CETP编码基因的重组噬菌体作为疫苗种子接种于用LB培养基37℃新鲜培养的OD600为1.0 的BLT5403菌液进行大量扩增，得到动脉粥样硬化疫苗原液；D 、动脉粥样硬化疫苗的浓缩纯化：在步骤C所得动脉粥样硬化疫苗原液中加入氯化钠固体，加入量为：每1L动脉粥样硬化疫苗原液中加入58.6g氯化钠，振摇至溶解，促进细菌碎片沉淀，4℃，4000rpm离心20min，收集上清加入PEG8000，加入量为：每1L动脉粥样硬化疫苗原液中加入100g PEG8000，振荡至完全溶解后，4℃过夜；4℃，10000rpm离心30min，弃上清，取沉淀，将每1L动脉粥样硬化疫苗原液所得沉淀用20mL噬菌体稀释液剧烈抽提沉淀，4℃、10000rpm离心15min，收集上清，再重复抽提1次，将两次抽提离心所得上清液合并，即为动脉粥样硬化疫苗的浓缩液，并用噬斑法测定该浓缩液中重组噬菌体滴度；其中，所述噬菌体稀释液成分如下：每1L噬菌体稀释液含1molNaCl，10mmolTris‑HCl，该Tris‑HCl的pH为8.0，1mmol EDTA；E 、动脉粥样硬化疫苗的甲醛灭活：将步骤D所得动脉粥样硬化疫苗浓缩液按照每4000mL动脉粥样硬化疫苗的浓缩液加入1g甲醛的比例加入甲醛，37℃ 100rpm振荡灭活4天后检测滴度为0，按每1mL噬菌体溶液加入100μL NaHSO3的比例，中和动脉粥样硬化疫苗浓缩液中的残余甲醛，得到动脉粥样硬化疫苗灭活液；F、 将步骤E所得动脉粥样硬化疫苗灭活液用生理盐水稀释至所需浓度，得到动脉粥样硬化疫苗使用液。