[发明专利]一种诱导叶柄愈伤组织形成多倍体英国梧桐的方法

摘要

本发明提出了一种诱导叶柄愈伤组织形成多倍体英国梧桐的方法，是通过秋水仙素诱导叶柄愈伤组织加倍形成多倍体英国梧桐新品种（系），以用于解决英国梧桐的“飞毛”问题。其步骤为：a)英国梧桐优株种子的无菌萌发，b)无菌苗叶柄愈伤组织诱导，c)叶柄愈伤组织的秋水仙素处理，d)处理后愈伤组织的恢复培养，e)愈伤组织分化出苗，f)芽苗分化出根，g)组培植株的移植，h)成活植株后的观察和选择，i)选株的无性扩繁成稳定品种（系）。本发明的多倍体英国梧桐新品种，有利于产生少种子或无种子的球果，免除了飞毛的产生，减少了城市污染，美化了城市环境。

主权项

一种诱导叶柄愈伤组织形成多倍体英国梧桐的方法，其特征在于选育过程为：a.英国梧桐优株种子的无菌萌发选择优良英国梧桐单株的种子经过0.1%升汞消毒处理16min—20min后，接种在萌发培养基上，在25℃黑暗或1500lx光照12hr/d下萌发，接种7天—15天后种子萌发出苗；所述萌发培养基配方为：1/2MS大量元素+MS的有机成分+MS的微量元素+MS的铁盐+0.1mg/L—0.3mg/L6BA+4%蔗糖+0.75%琼脂，pH5.8；b.无菌苗叶柄愈伤组织诱导当无菌苗生长3个—5个叶片时，在超净工作台上剪下完整叶片，保留0.5cm—0.8cm叶柄和叶柄上1/5的叶片，再将剪好的叶片的叶柄直立插入到叶柄愈伤组织诱导培养基中，置于20001X光照10hr/d，25℃条件下培养，15天—25天在叶柄基部出现黄色紧实的圆球形愈伤组织；所述诱导培养基配方为MS+1.0 mg/L~2.0mg/L 6BA+1.0 ~2.5mg/L NAA+4%  Sucrose+0.75%琼脂 ，pH5.8；c．叶柄愈伤组织的秋水仙素处理当叶柄愈伤组织生长到35天—40天时，将愈伤组织置于添加500mg/L~750ml/L秋水仙素，但不加琼脂的叶柄愈伤组织加倍培养基中，放在温室（25℃）摇床上，在50转~60转/分钟的速度下旋转培养48hr~60hr；所述加倍培养基配方为：MS+500mg/L~750mg/L秋水仙素+1.0mg/L~2.0mg/L 6BA+1.0mg/L~2.5mg/LNAA+4% Sucrose ，pH5.8；d．处理后愈伤组织的恢复培养叶柄愈伤组织加倍处理完毕，取出愈伤组织经无菌水冲洗和吸干表面水分后，接种到叶柄愈伤组织诱导培养基上，恢复培养7天；e．愈伤组织分化出芽苗经恢复培养的愈伤组织接种到分化培养基中分化培养15天~20天后愈伤组织呈现绿点，25天~45天后陆续分化出芽苗，并可见丛苗出现；所述分化培养基配方为：MS+1.5mg/L~3.0mg/L 6BA+3% Sucrose+0.75% agar， pH5.8；f．芽苗分化出根当芽苗分化生长到2.0cm—8.0cm时，将芽苗靠近愈伤组织处剪断移植于生根培养基中，20天~25天后芽苗基部分化出根而形成完整的组织培养植株；所述生根培养基配方为：1/2MS+0.1mg/ L ~1.0mg/ L IBA+2% sucrose+0.75% agar，pH5.8；g．组培植株的移植当组培植株生长到8.0cm~12.0cm高，具有1个~3个根的时候，将进行组培植株的移植，首先将要移植植株的培养瓶盖打开，每瓶添加10ml~15ml无菌水，放到常温的实验室内缓苗2天，然后充分清洗掉植株根部的培养基，将植株移栽到灭菌的70%蛭石+15%细砂+15%园土的基质中，浇上1/10MS大量元素溶液，盖上薄膜和黑网，然后每2天喷洒1/10MS大量元素溶液，直至植株成活，再逐步揭开黑网和薄膜，使组培苗健壮生长；h．成活植株的比较观察与选择根据多倍体和二倍体植株外部形态的差异，选取叶片变厚，叶色变浓的植株为初选多倍体株，再取候选多倍体株的叶片表皮细胞观察气孔密度和气孔保卫细胞内的叶绿体数多倍体植株气孔密度变小，气孔变大，保卫细胞内的叶绿体数目接近二倍体英国梧桐的二倍；再将多倍体叶片和二倍体叶片的细胞核进行细胞流式分析仪的DNA含量测定，多倍体材料叶片中DNA含量相对为二倍体DNA量的二倍；经过形态特征，气孔观察和DNA含量测定都明确显示出多倍体特点的植株确定为多倍体英国梧桐单株；i.选株经无性扩繁成稳定品种、品系将已确定为多倍体英国梧桐的单株生长到80cm‑100cm时截取枝条，按每茎段含3个芽作为繁殖茎段，于立春后的2天‑20天内插植于苗床上进行无性扩繁，而成为稳定的多倍体英国梧桐品种（系）。