[发明专利]以单倍体玉米茎尖为受体的转基因育种方法

摘要

本发明公开了以单倍体玉米茎尖为受体的转基因育种方法，其包括：1.单倍体材料的获得及前处理；2.单倍体材料的培养；3.目的基因转化单倍体茎尖；4.转化苗的移栽和加倍处理。本发明的方法避免了玉米组织培养及再生过程，适用于大多数基因型玉米的遗传转化；以单倍体玉米茎尖为转基因受体的遗传转化技术是简易高效、省时省力、广泛适用的一种快速获得转基因玉米纯合体的新方法。

主权项

以单倍体玉米茎尖为受体的转基因育种方法，包括如下步骤：(1)用单倍体诱导系stock6做为父本，以西南地区玉米骨干自交系18‑599作为母本，进行杂交组配并收获F1代杂交种，从获得的种子中挑选胚乳顶部为紫色而胚为白色的种子，该种子大部分为单倍体；弃去胚乳顶部和胚均为紫色的二倍体种子；(2)对获得的单倍体种子进行消毒，然后在培养箱中进行黑暗条件下培养，待胚芽生长到2～4cm：(3)以含目的基因的表达载体制备含目的基因表达载体的转化农杆菌，筛选转化的农杆菌并制备成侵染液；(4)切单倍体茎尖：在超净工作台上垫上提前灭过菌的滤纸，然后从培养基上用镊子取出步骤(2)中待转化的发芽植株，用手术刀先切去种子胚根，在茎节鼓起处以上1毫米左右的部分横向微切，轻轻剥去胚芽鞘露出茎尖生长点，再从中部纵向切伤茎尖生长点，伤口深度约1mm；(5)农杆菌侵染茎尖：摆放好茎尖的培养皿置于真空干燥器中，并垫上泡沫塑料使其向茎尖一边倾斜，然后农杆菌侵染液滴加在培养皿中茎尖一方，使茎尖能完全接触菌液，完全盖上真空干燥器盖子，在30‑70kPa压力下侵染6～12min；(6)共培养：侵染结束后，用吸管快速吸净培养皿上多余的菌液，置于21～25℃继续暗培养4～6天，直至长出新叶，且节根长至1～2cm；(7)共培养结束后，将长出新叶的转化苗用室温下的自来水洗掉表面的培养基和菌体，然后将其整齐的移栽到土壤中，先置于人工气候室避光生长2～3d，然后让植株在日温22～28℃、夜温15～21℃的条件下生长，直至植株3叶1心期；任选的，包括根尖镜检筛选阳性单倍体步骤；(8)阳性单倍体植株的加倍处理：待步骤(7)中的阳性单倍体植株和对照植株生长至四叶一心期时，用除草剂进行加倍，具体方法为：将二甲基亚砜溶解甲基胺草磷溶液用滴管滴至单倍体植株的心叶处，每株约0.5‑1.5ml，重复2‑4次；(9)阳性纯合转基因二倍体种子的获得加倍处理后，待植株长至5叶期将其移栽到温室或大田，花期能正常散粉的均为加倍成功的阳性植株，将它们进行套袋自交，收获的种子即为纯合的转基因二倍体种子。