[发明专利]一种胚挽救和离体诱导相结合构建异源多倍体水稻的方法

摘要

本发明提出了一种“胚挽救和离体诱导相结合构建异源多倍体水稻的方法”，其步骤为：a.暗处理野生稻使其会聚栽培稻开花期；b.栽培稻与野生稻杂交；c.杂交后喷洒幼胚发育促进液；d.胚挽救培养；e.杂交胚生长出芽苗或愈伤组织；f.秋水仙素处理芽苗或愈伤组织；g.处理后芽苗或愈伤组织的恢复培养；h.芽苗的生根培养或愈伤组织的分化培养；i.组培苗的移植；j.异源杂种苗选择；k.异源四倍体或异源六倍体水稻的确定。利用本发明可以获得多个基因组间多个物种的异源杂种和异源多倍体，为栽培稻/野生稻杂交育种和充分利用野生稻有利基因开拓了新途径。

主权项

一种胚挽救和离体诱导相结合构建异源多倍体水稻的方法，其特征在于该过程为：a 暗处理野生稻会聚栽培稻开花期由于野生稻是典型的短日照植物，在亚热带到温带地区自然情况下，绝大多数野生稻物种不能在栽培稻品种开花时开花；为了使两类亲本的开花期相遇，对野生稻进行短日照处理，光照时间控制在8.5hr—9.0hr/d，共处理30天，使野生稻进入生殖生长期相继开花，与栽培稻品种的花期相遇；b 栽培稻与野生稻杂交考虑到野生稻凌晨开花，而花粉在30分钟内失活的特点和野生稻容易落粒的特性，以栽培稻为母本，于杂交前一日下午去雄后套袋，以野生稻为父本，于开花当日的凌晨5：00‑8：30取野生稻的开花穗，将花粉抖落在已去雄的栽培稻穗子上完成授粉，然后套袋注明杂交的父母本及日期；c 杂交后喷洒幼胚发育促进液授粉后的第2天～12天，每天下午打开杂交袋向稻穗喷洒10mg/l～30mg/l 2,4—D+50mg/1～100mg/1GA3的幼胚发育促进液，促进杂交胚的发育；d.胚挽救培养授粉后的第7天～12天取出杂交子房，经消毒处理后，接种到N6 + 0.5mg/l～2.0mg/l 6‑BA +0.5mg/l～2.0mg/l  NAA + 5%蔗糖 + 0.75％琼脂的胚挽救培养基中，置于25℃，暗条件下培养；e.杂交胚生长出芽苗或愈伤组织培养3～4周后，杂交胚一方面长出芽苗，另一方面会诱导出愈伤组织，此时在光照2000 LX，10hr‑12hr/d 25℃下培养7～10天，让芽苗长丛芽或愈伤组织旺盛长大；f.秋水仙素处理芽苗或愈伤组织将生长旺盛的丛芽苗置于N6 + 0.5mg/l～1.0mg/l NAA + 1.5mg/l～2.0mg/l 6‑BA + 3%蔗糖 + 500mg/l～750mg/l秋水仙素的芽苗加倍培养基中；或者将生长旺盛的愈伤组织置于N6 +  0.3mg/l～0.5mg/l NAA + 0.5mg/l～1.0mg/l 6‑BA+1.0mg/l～1.5mg/l 2，4‑D+ 5% 蔗糖+ 500mg/l～750mg/l秋水仙素的愈伤组织加倍培养基中，置于温室（25℃），每分钟50转‑60转摇床处理48hr‑60hr.g.处理后芽苗或愈伤组织的恢复培养取出加倍处理的芽苗或愈伤组织用无菌水冲洗三次，无菌滤纸吸干表面水分后，将芽苗转接于N6 + 0.5mg/l～1.0mg/l NAA +1.5mg/l～2.0mg/l 6‑BA + 3% 蔗糖+ 0.75％琼脂的芽苗恢复培养基中，将愈伤组织转接于N6 + 0.3mg/l～0.5mg/l NAA + 0.5mg/l～1.0mg/l 6‑BA +1.0mg/l～1.5mg/l 2，4‑D+ 5% 蔗糖+ 0.75％琼脂的愈伤组织恢复培养基中恢复培养7‑10天；h. 芽苗的生根培养或愈伤组织的分化培养    将恢复的芽苗接种到1/2MS + 0.3mg/l ～ 0.5mg/l 6BA + 0.3mg/l ～ 0.5mg/l NAA + 2%sucrose + 0.75% agar 的生根培养基中生根而成为完整的小植株；将恢复的愈伤组织接种到MS + 0.3mg/l ～ 0.5mg/l NAA +1.5mg/l～2.0mg/l 6BA +0.5mg/l～1.0mg/l KT +3%sucrose + 0.75% agar 的分化培养基中分化出苗，再转接到芽苗生根培养基中分化出根而成为小植株；i. 组培苗的移植将组培苗的瓶塞打开，加入10ml～15ml 无菌水，置于实验室（20℃～25℃）炼苗2天，于下午4:30后，用清水洗净组培苗根部后移植于整平细的小苗床水田中，罩上遮阳网，保持苗床湿润，并于中午朝遮阳网内喷施1/10MS大量元素和微量元素溶液，连续5天，使秧苗正常生长后打开遮阳网；j. 异源杂种苗的选择    将杂种苗与栽培稻和野生稻亲本进行观察比较，从植株形态，叶片大小，叶鞘颜色，稻穗形状，颖壳大小，芒的有无和长短等性状差异中，初步挑选出栽培稻／野生稻的异源杂种苗；k. 异源多倍体或异源六倍体水稻的确定利用根尖染色体制片技术，观察异源杂种苗的根尖染色体数目，确定杂种是异源四倍体（如栽培稻（AA）与斑点野生稻（BB）杂种2n=4X=AABB=48），或异源六倍体（如栽培稻（AA）与高秆野生稻（CCDD）的杂种，2n=6X=AACCDD=72），然后再用基因组原位杂交技术（GISH）或不同基因组专有的分子标记确定杂种是否为异源多倍体。