[发明专利]核酸试纸条法检测ERCC1第118位密码子位点多态性

摘要

本发明就是在PCR扩增靶模板的基础上，利用带标记的引物进行等位基因特异性扩增，并最终利用核酸试纸条进行ERCC1第118位密码子检测的技术，其检测的主要原理是根据抗原和其特异性抗体的免疫学特异性结合，将核酸片段固定在核酸检测试纸条上，然后通过可视的呈色乳胶颗粒在试纸条上显色而检测出结果，在PCR&AS-PCR核酸试纸条法检测ERCC1第118位密码子多态性中主要包括用于PCR扩增的特异性PCR扩增引物，一条5’末端带生物素标记的等位基因特异性引物，一条3’末端带FITC标记的特异性探针，PCR&AS-PCR核酸试纸条法检测ERCC1第118位密码子多态性基因型。

主权项

一种核酸试纸条法检测ERCC1第118位密码子位点多态性，a,取样，冻存的被检者外周静脉抗凝血200ul，用微量DNA快速提取试剂盒进行核酸提取；b：先对包含ERCC1第118位密码子多态性位点的靶模板通过PCR进行扩增，同时进行PCR扩增的引物并不进行任何的标记；其特征在于：c：在步骤b的基础上，利用AS‑PCR根据ERCC1第118位密码子多态性基因型的碱基类型进行特异性扩增，在灭菌的0.2ml PCR管中，在20ul的反应体系中，针对不同的基因型分加入不同的PCR扩增引物和探针；PCR & AS‑PCR核酸试纸条法检测ERCC1第118位密码子多态性反应体系：模板：一个被检者基因组DNA，PCR引物：181PF和181PR  各0.2‑2微摩，      标记的引物：181D5F‑C/181D5G‑A  各0.1‑1微摩，特异性探针：181D3B   0.1‑1微摩，dNTP：                          0.2‑0.5毫摩(NH₄)₂SO₄                        10毫摩KCl                             10毫摩Tris‑HCl（PH 9.0）              10毫摩Triton‑100                      1.0%MgCl₂                            1.5‑3毫摩Taq DNA聚合酶：                 1‑5单位总体积为20微升短暂离心后进行PCR循环。PCR循环参数为95 ℃ 5min；93‑96 1min；60‑72℃ 1min；72 ℃ 2min；30‑50个循环；93‑96℃ 30s；45 ‑55℃ 1min；2‑10个循环；95 ℃ 5min；在AS‑PCR扩增线性扩增过程中，将反应的退火温度将到适合181D5F‑C 和181D5G‑A延伸的温度；d：在试纸条上，将特异性抗体即抗A抗体吸附于乳胶颗粒，在乳胶颗粒表面形成抗体包被；将另一无色特异性抗体即抗B抗体，以线条状固定于膜上，形成检测线；e：检测结果：将反应产物全部滴于核酸试纸条的加样处，加上100ul的缓冲液，带抗原A和抗原B的杂交产物首先与颗粒表面的抗体A结合，形成抗原B－寡核苷酸链抗原A‑颗粒抗体A的有色颗粒复合物，有色的复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动，当复合物遇到固定于膜上的抗体B线条时，待检的抗原B－寡核苷酸链抗原A‑颗粒抗体A复合物与线条上的抗体B结合，形成线条抗体B－抗原B－寡核苷酸链抗原A‑颗粒抗体A的有色颗粒复合物，有色的线条抗体B－抗原B－寡核苷酸链抗原A‑颗粒抗体A的颗粒复合物滞留在线上，形成肉眼可见的有色线条；2A：核酸试纸条检测的结果：1. TT纯合子；2. CC纯合子。2B：对应的测序结果，划红线的碱基为所要检测的位点：1. TT纯合子；2. CC纯合子。