[发明专利]猪流行性腹泻病毒分离培养方法无效
申请号: | 201210470116.2 | 申请日: | 2012-11-19 |
公开(公告)号: | CN103820396A | 公开(公告)日: | 2014-05-28 |
发明(设计)人: | 张春玲;倪建平;訾玉华;何锡忠;李春华;蒋凤英;张婉华;周宗清;彭丽英 | 申请(专利权)人: | 上海佳牧生物制品有限公司;上海市农业科学院 |
主分类号: | C12N7/00 | 分类号: | C12N7/00;C12R1/93 |
代理公司: | 上海科盛知识产权代理有限公司 31225 | 代理人: | 林君如 |
地址: | 201106 *** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | 本发明涉及猪流行性腹泻病毒分离培养方法,将仔猪动小肠冲洗干净后利用培养基进行培养,并进行接种,检测为阳性的PEDV样品用生理盐水稀释成体积比为1∶1的悬液,培养收获出现细胞病变(CPE)后收获细胞,继续冻融接种单层vero细胞,利用培养基培养得到出现细胞病变(CPE)后收获细胞,既分离得到猪流行性腹泻病毒。与现有技术相比,本发明的分离成功率高,分离得到的猪流行性腹泻病毒病毒毒力强、分离的病毒纯度高。 | ||
搜索关键词: | 流行性 腹泻 病毒 分离 培养 方法 | ||
【主权项】:
猪流行性腹泻病毒分离培养方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:(1)将仔猪动脉放血致死,无菌操作取出小肠,剔除肠系膜,置于37℃预热的DMEM‑F12不完全培养基的平皿中备用;(2)将小肠剪成8~10cm,用注射器吸取PBS液从一端向另一端缓慢冲洗,反复进行冲洗直至将肠内容物全部冲洗出,液体清亮为止,纵向剖开肠管,用清洗液清洗数次,取出小肠,利用DMEM‑F12完全培养基分离IEC细胞,用玻片轻轻刮取肠粘膜组织,用移液器吹打均匀后转移到细胞培养瓶中,加入无菌II型胶原酶至0.1wt%终浓度;分别置4℃和37℃各消化12h和2h后加等量的DMEM‑F12完全培养基终止消化,在1000r/min离心10min后移去上层清液并用DMEM‑F 12完全培养基悬浮,重复一次后完全培养基悬浮并计数,按(1~5)×105密度接种六孔板,37℃、5v/v%CO2培养;(3)检测为阳性的PEDV样品用生理盐水稀释成体积比为1∶1的悬液,反复冻融3次,上清液经0.45u滤膜过滤,接种于单层猪IEC细胞,37℃吸附1h,加DMEM‑F12完全培养基培养,37℃、5v/v%CO2培养,出现细胞病变(CPE)后收获细胞;(4)将收获的病变细胞反复冻融三次,接种单层vero细胞,37℃吸附1h,加DMEM‑F12完全培养基培养,37℃、5v/v%CO2培养,出现细胞病变(CPE)后收获细胞,既分离得到猪流行性腹泻病毒。
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