[发明专利]养殖麝香的多肽电泳图谱检测方法

摘要

本发明公开了一种中药检测方法，具体涉及一种养殖麝香的多肽电泳图谱检测方法。本发明采用电泳上样缓冲液直接提取分析，每个样品的用量仅需几毫克，该方法为养殖麝香的鉴别建立了一种简便可行的辅助手段。

主权项

一种养殖麝香的多肽电泳图谱检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：A、养殖麝香凝胶电泳分析样品的制备称取养殖麝香样品0.003~0.008重量份，加入1体积份乙醚，超声提取15~25min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加0.05体积份电泳上样缓冲液（1X），超声提取15~25min，在4500rpm，10℃条件下离心15~25min，取上清，加0.02%溴酚蓝，沸水浴3~8min，即得电泳样品；B、Tricine‑SDS‑PAGE凝胶电泳分析方法（1）电泳溶液准备：(a)去离子水溶解100~150重量份Tris，用HCl调PH值至7~9，定容至500体积份，制得正极缓冲液（10×）；(b)去离子水溶解50~70重量份Tris，80~100重量份Tricine，3~8重量份SDS，定容至500体积份，制得负极缓冲液（10×）；(c)去离子水溶解150~200重量份Tris，1~2重量份SDS，用HCl调PH值至7~9，定容至500体积份，制得凝胶缓冲液（3×）；(d)40~60%丙烯酰胺，1~2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液；(e)40~60%丙烯酰胺，1~5%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；(f)0.2~1体积份1mol/L，PH为6.8的Tris‑HCl，2~4体积份甘油，1~3体积份10% SDS，0.6~1体积份β巯基乙醇，0.5~1.5体积份1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10体积份，制得上样缓冲液(6×)；(g)0.2~1体积份1mol/L，PH为6.8的Tris‑HCl，2~4体积份甘油，1~3体积份10% SDS，0.6~1体积份β巯基乙醇，加蒸馏水补足60体积份，制得上样缓冲液(1×)；（2）凝胶制备：分离胶3体积份：取上述制得的凝胶缓冲液(3×)1体积份，0.2~0.6重量份甘油，0.5~1.5体积份6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2~4体积份，临 用时加入0.005~0.02体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0005~0.002体积份TEMED；夹层胶3体积份：取上述制得的凝胶缓冲液(3×)0.5~1.5体积份，0.5~0.8体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2~4体积份,临用时加入0.005~0.02体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0005~0.002体积份TEMED；浓缩胶2体积份：0.4~0.6体积份凝胶缓冲液(3×)，0.1~0.2体积份3C储液，去离子水稀释至1~3体积份，临用时加入0.005~0.02体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0005~0.002体积份TEMED；（3）电泳条件：120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部1cm处（4）染色方法采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制：固定液：量取甲醇30‑60体积份，冰醋酸5‑20ml，加双蒸水稀释至100ml)；染色液：称取0.5~1.0重量份AgNO3溶于3~5体积份双蒸水中；取洁净烧杯，加入0.36% NaOH 15~30体积份，再加入氨水1~2体积份混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至100体积份；显色液：0.3~0.8体积份1﹪柠檬酸，0.03~0.08体积份甲醛，加双蒸水至100体积份；终止液：量取冰醋酸1体积份，加双蒸水稀释至100体积份；C、具体染色步骤：(a)电泳结束后，将凝胶转移至固定液中固定0.5~1.5h，每10~30min换一次液；(b)弃去固定液，凝胶以双蒸水中漂洗3次，每次5~15min；(c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色10~20min；(d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗2~4min；(e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液；(f)将胶转移至终止液终止染色；(g)在蒸馏水中漂洗凝胶0.5~1.5h；(h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存;各批次养殖麝香中，出现分子量约为67kDa、7kDa的蛋白条带；养殖麝香样品中均出现分子量约为19KDa的弱染色条带。