[发明专利]一种用于检测辣椒疫霉的引物及其检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种用于检测辣椒疫霉的引物及其检测试剂盒，其特征在于辣椒疫霉特异性检测引物为：上游(20bp) PcyktF: AGATGGTATGTCGCTATGAC、下游(20bp) PcyktR: ACATTTCGTAACGTCAACAT，疫霉菌通用引物为：上游（21bp）PyktF：AGAGTTGCTGCGCCAGGATGG、下游（21bp）PyktR：GTCTTGGACAACACGGCGGTG。本发明找到了一个潜在的疫霉属通用检测引物，通过实验验证，该引物可在实验提供的14个不同疫霉种扩增出一条约630bp(不同种间大小有差异)大小的条带，为其它疫霉种的分子检测提供了一个潜在的分子靶标。

主权项

一种用于检测辣椒疫霉的引物及其检测试剂盒，其特征在于所述的辣椒疫霉分子检测引物为：上游(20bp) PcyktF: AGATGGTATGTCGCTATGAC下游(20bp) PcyktR: ACATTTCGTAACGTCAACAT，所述的疫霉属通用引物为：上游（21bp）PyktF：AGAGTTGCTGCGCCAGGATGG下游（21bp）PyktR：GTCTTGGACAACACGGCGGTG所述的检测试剂盒为：检测溶液Ⅰ包括： 25mmol Tris.Cl(PH 8.3)、125mmol KCl、3.75 mmol MgCl2、0.25mmoldNTPs、疫霉属的通用引物PyktF/PyktR各 1μmol、0.1mgBSA、Taq DNA聚合酶50U，加入超纯水制备成1mL检测溶液；保存期限为1年；检测溶液Ⅱ包括：25mmol Tris.Cl(PH 8.3)、125mmol KCl、3.75 mmol MgCl2、0.25mmoldNTPs、辣椒疫霉疫霉特异性引物PcyktF/PcyktR各 1μmol、0.1mgBSA、Taq DNA聚合酶50U，加入超纯水制备成1mL检测溶液；保存期限为1年；所述的检测试剂盒的使用方法为：当直接使用辣椒疫霉特异性引物进行检测时，提取待检测物DNA，取5μL溶液作为反应模板，取试剂盒Ⅱ中的溶液10μL，另取10μL去离子水加入200μL反应小管中，混匀后PCR扩增，程序为94℃变性3分钟，94℃变性30秒；58℃退火30秒；72℃延伸30秒；32 个循环，最后72℃延伸5分钟；当使用套式PCR进行检测时，提取待检测物DNA，取5μL溶液作为反应模板，取试剂盒Ⅰ中的溶液10μL，另取10μL去离子水加入200μL反应小管中，混匀后PCR扩增，程序为94℃变性3分钟，94℃变性30秒；58℃退火30秒；72℃延伸30秒；32 个循环，最后72℃延伸5分钟；将反应结束后的PCR产物用水稀释5倍后取5μL，取试剂盒Ⅱ中的溶液10μL，另取10μL去离子水加入200μL反应小管中，混匀后PCR扩增，程序为94℃变性3分钟，94℃变性30秒；58℃退火30秒；72℃延伸30秒；32 个循环，最后72℃延伸5分钟；扩增产物的电泳检测：取10μL PCR扩增产物，在1%（质量体积比）的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为120V，20分钟后在紫外光下检测结果；如果存在分子量约为282bp的条带，则证明所检病原为辣椒疫霉。