[发明专利]一种嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大肠杆菌Ecoli-SL26的构建方法

摘要

本发明公开了一种嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大肠杆菌Ecoli-SL26的构建方法，本方法采用Red/ET系统同源重组敲除嘌呤核苷磷酸化酶基因，在四环素（Tet）和卡那霉素（Kam）双重抗性下筛选到了嘌呤核苷磷酸化酶基因成功敲除的菌株Eocli-SL26。本发明成功沉默了肌苷水解为次黄嘌呤的途径，提高了酶催化的转化率和5`-磷酸化肌苷的纯度，降低了肌苷的损耗和生产成本，有利于后续5`-磷酸化肌苷的提取和残余肌苷的套用，该发明对酶催化肌苷5`-磷酸化的产业化进程具有重要意义。

主权项

一种嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大肠杆菌Ecoli‑SL26的构建方法，其特征在于包括如下步骤：（1）通过NCBI查找大肠杆菌PNP基因，设计引物PCR扩增得到同源重组缺失的嘌呤磷酸化酶基因，以验证宿主中PNP的存在；所述引物为：PNP‑upper: 5’‑TTTTGATGCCAGGCGACCCG‑3’；PNP‑lower: 5’‑CGGATGTGGTCAGATACGGT‑3’；（2）通过NCBI查找大肠杆菌PNP基因及其上下游基因的同源性情况，根据K006‑Ecoli‑Gene Deletion Kit要求，合成可行的同源臂引物PCR，扩增得到在Red/ET系统同源重组中的功能片段；所述功能段扩征的引物为：deoD‑FRT‑f：5'‑CTGATGGATTTGGGCGGAGCGTTGACTCCGCCTTTGTTATGTCACAAAAAGGATAAAACAAATTAACCCTCACTAAAGGGCG；deoD‑FRT‑r：5'‑AAAGCCGGAGCAGTCTCCCGCTCCGGCTTCACAAGGCAATCGCCTTGCAGCGAAACACAATAATACGACTCACTATAGGGCTC；（3）制备宿主的感受态细胞，电转质粒pRedET，帮助功能片段同源重组：（4）阿拉伯糖诱导含有pRedET的感受态宿主后，电转化线性的功能片段；（5）在pRedET质粒的帮助下，功能片段与染色体基因组上的PNP进行同源重组：（6）电转化表达质粒706‑FlP，帮助消除同源整合到染色体上的抗性标记：（7）通过温度变化，消除抗性标记以及丢失表达质粒706‑FlP。