[发明专利]一种蛹虫草半连续液体发酵生产虫草素的方法

摘要

本发明公开了一种蛹虫草半连续液体发酵生产虫草素的方法。具体操作步骤如下：（1）将蛹虫草（Cordycepsmilitaris）的菌丝接到PDA固体培养基上活化，生成大量浓密菌丝的菌苔；（2）将菌苔接到种子培养基振荡培养，5天后形成大量菌球体，制得种子液；（3）将种子液转接到种子液发酵罐进行扩培；（4）将扩培种子液再转接到500L罐进行首批发酵；（5）相同条件下，500L罐10批次半连续发酵。本发酵工艺中采用调节培养基组成及发酵条件的方法，控制蛹虫草形成形状规则、大小均一的菌丝球，其直径平均在3~5mm，易于发酵液和菌体分离；利用蛹虫草菌丝球反复发酵，节约菌丝球生长所需的碳氮源及其他无机盐，节约了成本；缩短了发酵周期，提高了发酵强度，适于工业生产。

主权项

一种蛹虫草半连续液体发酵生产虫草素的方法，其特征在于：A、菌种活化：将蛹虫草（Cordyceps militaris）的菌丝接种到PDA固体培养基上，温度20～25℃条件下避光培养5d，菌丝长满培养基平面，转到见光条件下，培养5d，菌丝全部由白转至橙黄，得到活化的菌苔；B、制备种子液：取面积6～10 mm2的菌苔1～2块接入种子培养基，摇瓶的装液量为130/250 mL，于温度20～25℃、摇床转速为120～150 r/min条件下，培养5～7d，得到种子液，种子液中的菌丝球形态规则、颗粒均匀；种子培养基的制备方法：土豆汁200 mL、酵母10 g、葡萄糖40 g、磷酸二氢钾（KH2PO4）2.0 g和硫酸镁（MgSO4）1.0 g混匀，补水至1000mL，pH自然，121℃高压灭菌20min；土豆汁的做法：去皮马铃薯100 g，加500 mL自来水煮沸20min，用4～6层纱布过滤，滤液补足到500mL； C、种子液的扩培：将1L种子液转接至9L液体培养基中，温度20～25℃、通气流量1.5～2.0 L/(L·min)、搅拌速度100～120 r/min条件下，搅拌培养5～7 d，实现菌丝球的更新与扩增，制得蛹虫草种子液；所述液体培养基及制备方法同B步骤中的种子培养基及制备方法；D、500 L罐首批发酵将30L蛹虫草种子液转接到发酵罐的发酵培养基中，发酵罐的装液系数0.75，在温度20～25℃、通气1.5～2.0 L/(L·min)、搅拌速度100～120 r/min条件下，培养10 d；发酵结束，截留住蛹虫草菌丝球，正压放料300 L，首批发酵得虫草素产量为63.91 mg/L；所述发酵培养基的制备方法：将酵母粉10‑15 g、葡萄糖30‑40 g、磷酸二氢钾（KH2PO4）2.0‑3.0 g、硫酸镁（MgSO4） 1.0‑2.0 g、磷酸氢二钾（K2HPO4）1.0‑2.0 g、硝酸钾（KNO3） 0.5‑1.0 g和硫酸亚铁（FeSO4）0.1‑0.5 g 溶于1000mL水中，混匀，pH自然，121℃高压灭菌20min；E、500 L罐重复发酵重复D步骤进行10批次半连续发酵；即每次无菌正压放料排出发酵液300 L，再往罐内正压补充所述发酵培养基至原体积375 L，发酵控制条件不变；最后将11批次的发酵液合并，即得虫草素发酵液产品；重复批次发酵过程中的发酵培养基的制备方法：将酵母粉3‑5 g，葡萄糖15‑20 g、磷酸二氢钾（KH2PO4）2.0‑3.0 g、硫酸镁（MgSO4） 1.0‑2.0 g、磷酸氢二钾（K2HPO4）1.0‑2.0 g、硝酸钾（KNO3）0.5‑1.0 g和硫酸亚铁（FeSO4）0.1‑0.5 g溶于1000mL水中，混匀，pH自然，121℃高压灭菌20min；重复批次发酵过程中每批次发酵时间5 d，虫草素产量稳定在60 mg/L以上，发酵强度保持在15 mg/(L·d) 以上，细胞活力稳定在90%以上。