[发明专利]一种轮虫总RNA和总蛋白提取方法

摘要

本发明涉及一种提取轮虫总RNA和总蛋白的方法。方法包括一种淡水轮虫、轮虫通用培养液、食物微藻及其培养液、微孔筛网，解剖镜、低温冰箱、细胞破碎仪、低温离心机，充气泵、PVP、PBS磷酸缓冲液和RNA提取常规试剂（包括TRIZOL，氯仿，异丙醇，DEPC水，乙醇）。轮虫为单个体克隆培养获得、人工配制液体培养基培养、食物微藻为淡水微绿球藻、PBS磷酸缓冲液pH=7.0。采用恒温、充气、持续光照方法，快速获得大量轮虫，除去微藻，富集活体轮虫进行总RNA和总蛋白的提取。该方法能方便，快速，经济的收集到大量的轮虫，用于分子生物学研究，并能有效的消除微藻的影响，适合实验室研究应用。

主权项

一种轮虫总RNA和总蛋白提取的方法，其特征包括以下步骤：（1）轮虫培养（2）微藻去除：将轮虫培养液装入50ml离心管中，4500rpm，4℃离心5分钟，微藻沉积在离心管底部，倒出含有轮虫的上清，本步骤重复2‑3次直到藻类全部除去；（3）轮虫富集：将300目的筛网折成漏斗状，架于烧杯上，用胶头滴管吸取去除微藻的轮虫培养液，滴入筛网底部，滤去水分，之后用双蒸水冲洗数次，在解剖镜下用10‑100ml移液枪将轮虫吸到1.5ml离心管中；（3）冰冻：在超净台下，将轮虫转移到无RNA酶的离心管中，加1mlTRIZOL，上下颠倒数次，混匀后将离心管放入‑80℃冰箱中，使其完全结冰；（4）总RNA提取：将加TRIZOL的提取液室温融化，12000转4℃离心5min；吸取上清移入新的1.5ml离心管中，加入氯仿，剧烈震荡15s，充分乳化后室温静置5min，12000转4℃离心15min；从离心机中取出，离心管中分三层，吸取上清移入新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后在15‑30℃下静置10min，12000转4℃离心10min，弃上清，缓慢加入75%乙醇1ml，上下颠倒，12000转4℃离心5min，去除乙醇，室温干燥2‑5min，加入26ulDEPC水，‑70℃保存；（5）细胞破碎：向步骤3离心管中加入3ml 1%PVP，震荡混匀，超声破碎10‑20次，功率300W，破碎持续时间2S，间隔5S；该步骤操作均在冰上进行；（6）总蛋白提取：破碎后4000转，4℃离心10分钟，取上清。