[发明专利]通过基因枪介导红叶石楠叶片胚性愈伤组织遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种通过基因枪介导红叶石楠叶片胚性愈伤组织遗传转化方法，是以红叶石楠组培苗叶片为材料，在诱导培养基上诱导胚性愈伤组织，提供转基因的受体材料。采用基因枪轰击法将外源基因导入受体细胞，经过筛选获得转基因植株。本发明方法优选的参数为胚性愈伤组织在添加渗透剂甘露醇浓度为0.3mol/L，添加DNA沉淀剂12.5mol/LCaCl250μl+0.1mol/L亚精胺50μl和基因枪轰击距离采用9cm，真空度大于28inHg，气体压力1100Psi，轰击1次时，转化效率最高。本发明取材不受季节限制，转化效率较高，适合于对农杆菌无效的植物，建立了适合红叶石楠可重复转化的优化技术体系。

主权项

一种通过基因枪介导红叶石楠叶片胚性愈伤组织遗传转化方法，步骤包括：①叶片胚性愈伤组织诱导培养，②叶片胚性愈伤组织渗透处理，③以叶片胚性愈伤组织为受体进行基因枪遗传转化及受体组织继代培养，④对转基因植株进行分子鉴定；其特征在于：步骤①所述叶片胚性愈伤组织诱导培养的方法是：在超净工作台中，剪取红叶石楠组培苗叶片，将其叶片边缘切去，沿叶脉横切成1±0.5cm2的块状，接种于H1培养基上预培，然后放于组培室内于白天25℃、夜间18℃黑暗条件下诱导胚性愈伤组织，15d后，叶片边缘长满了致密的粒状胚性愈伤组织；步骤②所述叶片胚性愈伤组织渗透处理的方法是：把胚性愈伤组织分成0.5±0.1cm2的块转移置H2培养基上，添加浓度为0.1～0.5mol/L的甘露醇进行渗透处理15h～16h，重复3次，将渗透处理后的胚性愈伤组织块紧密地排列在含有H1培养基的9.0cm培养皿内，每皿排列25～30个愈伤组织块；步骤③所述基因枪遗传转化的方法是：取颗粒直径为1.0um的金粉，灭菌待用，制备微弹时加入浓度为1ug/ul的RD29A质粒DNA 3μl，12.5mol/L的CaCl2 50ul+0.1mol/L的亚精胺50ul组成的DNA沉淀剂；轰击参数为可裂圆片与载体的距离为2.5cm，载体与阻挡网的距离为0.8cm，真空度大于28inHg，气体压力1100Psi，轰击距离9cm，金粉用量300ug/枪，每皿轰击1次，重复3次；步骤③所述受体组织继代培养的方法是：将轰击后的材料在H1培养基上继续黑暗培养5天后转入含有40～60mg/L卡那霉素的抗性培养基H3培养基上，于组培室内白天25℃、夜间18℃、光强为2000Lx的条件下进行分化筛选培养，连续筛选60～90d，生长正常的植株即为转基因抗性植株；待抗性苗苗高1～2cm时，剪切下来接种到不添加卡那霉素的分化培养基上进行快繁，当苗高3‑5cm时接种在生根培养基H4培养基上诱导生根；上述H1培养基的组成是：MS培养基、6‑苄基嘌呤2.0mg/L、萘乙酸5.0mg/L、2,4‑二氯苯氧乙酸0.5mg/L、琼脂5.5g/L、蔗糖30g/L，pH值5.8‑6.0；上述H2培养基的组成是：MS培养基、6‑苄基嘌呤2.0mg/L、萘乙酸5.0mg/L、2,4‑二氯苯氧乙酸0.5mg/L、0.1～0.5mol/L的甘露醇、琼脂5.5g/L、蔗糖30g/L，pH值5.8‑6.0；上述H3培养基的组成是：MS培养基、6‑苄基嘌呤1.0‑1.5mg/L、激动素1.0‑1.5mg/L、吲哚丁酸0.4‑0.6mg/L、卡那霉素40‑60mg/L、琼脂5.5g/L、蔗糖30g/L，pH值5.8‑6.0；上述H4培养基的组成是：1/2MS培养基、6‑苄基嘌呤0.4‑0.6mg/L、吲哚丁酸0.20‑0.30mg/L、萘乙酸0.10‑0.11mg/L、琼脂5.5g/L、蔗糖30g/L，pH值5.8‑6.0。