[发明专利]人胚中脑来源的神经干细胞体外定向分化为多巴胺能神经元方法

摘要

本发明提出一种将人胚中脑来源的神经干细胞体外定向分化为多巴胺能神经元的方法，其步骤包括：原代细胞的分离培养；神经干细胞的传代培养；含抗坏血酸培养液诱导分化培养；正常成人脑脊液分化培养；免疫组化染色检测；细胞计数。本发明的体外诱导形成多巴胺能神经元的方法，先采用一定浓度的抗坏血酸诱导分化，后采用正常成人脑脊液进一步使胚胎中脑来源的干细胞向多巴胺能神经细胞方向分化，可以获得最高比例的多巴胺能神经元，这为体内外更有效地产生DA神经元，以用于临床移植治疗帕金森氏病提供新的思路。

主权项

一种将人胚中脑来源的神经干细胞体外定向分化为多巴胺能神经元的方法，其包括如下步骤： S1：原代细胞的分离培养:取胚龄10‑13周水囊引产的新鲜人胚胎，无菌条件在显微镜下分离出胚胎中脑组织，剥离脑膜及表面血管，在PBS液中漂洗三次，洗去血细胞,用细吸管轻柔吹打至组织碎块完全散开,离心洗涤后吹打制成悬液,经200目尼龙滤网过滤,制成单细胞悬液,无血清培养基培养,台盼蓝染色计数活细胞,调整活细胞浓度为1×105/mL,将原代细胞种植于25平方厘米培养瓶中,37℃,5%CO2条件下静置培养； S2：神经干细胞的传代培养:原代细胞培养出现大量悬浮克隆球后进行传代培养，用胰酶消化制成单细胞悬液，无血清培养基将细胞悬液按1×106/mL浓度传代接种于培养瓶，37℃,5%CO2条件下静置培养，直至次代克隆球产生，平均5‑7天传代一次； S3：含抗坏血酸培养液诱导分化:将不同代数的神经球体外培养七天后种植入含不同浓度抗坏血酸培养基（DMEM/F12+B27+AA）的培养皿中； S4：正常成人脑脊液分化培养:在以上含抗坏血酸培养液分化培养后3天，向培养基中加入正常成人脑脊液，比例为DMEM/F12+B27+30%脑脊液，观察其生长分化情况，在培养10天后进行免疫细胞化学染色； S5：免疫细胞化学染色:将含有分化细胞的培养板取出，4%多聚甲醛固定15min，PBS冲洗，TritonX‑100处理，羊血清封闭，加入兔抗人TH抗体（一抗）37℃处理1小时，PBS冲洗后加入生物素结合的羊抗兔IgG(二抗)37℃孵育45min，PBS冲洗后滴加SABC，最后DAB显色，苏木精复染，光镜下观察； S6：细胞计数：免疫细胞化学染色TH（+）的细胞代表多巴胺能神经元，苏木精复染，蓝色细胞核数代表总细胞数。倒置显微镜下（20×）对分化的细胞随机选择六个独立视野计数TH（+）细胞，及总细胞数；每次至少做四个独立实验。残留在神经球中的神经干细胞因聚合密集，难以计数，排除在外。