[发明专利]大胚龄神经干细胞的高-低密度贴壁细胞培养方法

摘要

本发明提供一种大胚龄神经干细胞的高-低密度贴壁细胞培养方法，所述培养方法包括以下步骤：皮层神经干细胞的分离和培养，高-低密度贴壁细胞培养法培养神经干细胞，神经干细胞的传代培养，神经干细胞的单细胞克隆，神经干细胞的分化培养以及免疫荧光法检测。本发明采用无血清培养和单细胞克隆技术从13周人胚大脑皮层中分离和培养出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞，采用先高密度而后密度逐渐递减的高-低密度贴壁细胞培养法，形成大量神经干细胞，该细胞具有连续克隆能力，可传达培养，表达神经巢蛋白抗原；分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原，解决了胚胎神经干细胞较难培养的问题。

主权项

一种大胚龄神经干细胞的高‑低密度贴壁细胞培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：皮层神经干细胞的分离和培养，高‑低密度贴壁细胞培养法培养神经干细胞，神经干细胞的传代培养，神经干细胞的单细胞克隆，神经干细胞的分化培养以及免疫荧光法检测；其中，所述皮层神经干细胞的分离和培养步骤包括：取13周自然流产和13周水囊引产的人胚胎，无菌条件下分离出胚胎前脑和大脑皮层组织，制成单细胞悬液，加入无血清培养基中，台盼蓝染色计数活细胞，调整细胞浓度为1×107/ml，分别种植于多聚赖氨酸包被的培养瓶中，37℃、体积浓度为5％CO2条件下静置进行贴壁细胞培养；所述高‑低密度贴壁细胞培养法培养神经干细胞的步骤包括：应用高密度贴壁细胞培养5天后后吸出部分细胞改为低密度培养，培养2周时经多次换液去除悬浮细胞继续培养至4周时形成大量大小不等的克隆球；所述的神经干细胞的传代培养步骤包括：待原代细胞培养出现大量悬浮克隆球后进行传代培养，无菌条件下在倒置显微镜下用自制玻璃微针将其中的大于200μm的大克隆球切成数块，继续培养，7～10天传代1次，方法同上述的高‑低密度贴壁细胞培养法培养神经干细胞的步骤；所述的神经干细胞的单细胞克隆步骤包括：在贴壁细胞培养中，当细胞密度降至1×104/ml时，挑选散在出现、明显增大、具有强折光性的细胞，在培养瓶底面用记号笔分别标记，动态定点观察并照相记录；当单个细胞形成克隆球并逐渐增大即将悬浮脱离时，用玻璃微管逐个吸出克隆球进行分化试验；将原代细胞制成单细胞悬液，稀释至40个/ml，于96孔培养板中滴加稀释的细胞悬液，每孔100μl，选取仅有1个细胞的培养孔作标记；所述神经干细胞的分化培养步骤包括：将以上获得的、来自单细胞的克隆球经胰酶消化后，种植于预先用多聚赖氨酸包被的小培养皿中，用DMEM/F12+5％Fcs+EGF+bFGF培养基和经过滤灭菌后的新鲜成人脑脊液中进行分化培养；所述免疫荧光法检测步骤包括：将上述获得的克隆球种入包被的小培养皿中，用无血清培养基贴壁培养12小时后行荧光检测；经分化培养后的细胞分别于2、7、14和21天行荧光检测。