[发明专利]一种表达猪传染性胃肠炎病毒基因工程菌制备方法

摘要

本发明公开了一种表达猪传染性胃肠炎病毒基因工程菌制备方法，包括以下步骤：1).总RNA的提取；２).S基因的克隆；３).表达载体的构建。乳酸乳球菌是人和大多数动物肠道内的常见细菌，本身具有抑菌抗菌、抗腹泻等特点，可以广泛开展活菌口服疫苗研究。本发明构建成的重组乳酸乳球菌MG1363/pMG36e-S能稳定可靠的表达具有活性的TGEV的S蛋白；该重组菌可用来生产基因工程亚单位疫苗和基因工程活载体疫苗，用于TGE的预防提供一个新方法；生产成本较低。

主权项

1.一种表达猪传染性胃肠炎病毒基因工程菌制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1). 总RNA的提取取已处理的TGEV细胞毒悬液250μl分别加入到无菌无RNA酶的离心管，再加入750μl TRIzol LS Reagent，颠倒混匀后于4℃静置5分钟；加入200μl预冷的氯仿，4℃保存；振荡至充分乳化均匀，4℃静置15分钟；于4℃、12000r/min离心15分钟，取出离心管，轻轻吸取上层水相约450μl移入另一离心管；加入等体积冷异丙醇，-20℃保存，颠倒混匀后置-20℃ 30分钟；4℃、12000r/min离心10分钟，取出离心管，弃去上清液，加入1毫升 75％的冷乙醇，-20℃保存，颠倒数次洗涤核酸；于4℃、12000r/min离心5分钟，取出离心管，弃去上清液，倒置EP管干燥核酸，然后用DEPC水20μl溶解，离心管中的溶液就是TGEV的总RNA；２).S基因的克隆根据TGEV S基因5和3，末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，每个引物的5，端包含一个方便将基因克隆到载体上的限制酶切位点；序列1：5’-cgttgtcgacccatgaaaaaactgttcgttgttctggttgtaat-3’序列2：5’-agaagcttttaatcgtgcacaccactattatcagacggtacaccc-3’这对引物序列1和序列2被用来进行RT-PCR扩增产生cDNA；取总RNA液8μl，加入1μl 40μ mol/L反向引物序列2，70~80℃变性5分钟，立即冰浴3分钟；随后依次加入4μl M-MLV 5×RT buffer，5μl 4mmol/L dNTPs，40u Rnasin，200u M-MLV，混合，离心，加入DEPC水使总体系达20μl，离心数秒种后，37℃水浴1小时，95℃10分钟灭活RT酶；cDNA的PCR扩增：10μl cDNA液，5μl 10×Ex Taq缓冲液，4单位EX Taq循环35次；EX Taq为一种高保真DNA聚合酶，同时能在扩增产物末端给出一个额外A用于T载体连接，两种40μ mol 引物序列1和序列2各0.5μl；4μl dNTP混合液，每管2.5mM，总体积为50μl；PCR温度循环程序为：95℃ 5分钟；94℃ 50秒，50℃ 50秒，72℃ 1分钟；72℃延伸10分钟；用1%琼脂糖凝胶电泳分离扩增片段，将相应的核酸带切下，并用小量胶提取试剂盒纯化；分离的S片段被连接到pMD18-T载体上；连接的DNA质粒转化E.coli DH5α，生长在含氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB板上的白色菌株被分离出来；提取质粒DNA，用限制性内切酶Sal和 HindⅢ和PCR法分析的存在和连接方向； ３).表达载体的构建将含有正确方向和序列的S基因片段用限制性内切酶切下，经酶切、胶回收纯化后与载体质粒pMG36e回收纯化后进行16℃过夜连接；将连接产物与电转化感受态细胞乳酸乳球菌MG1363轻柔混匀后，置冰上放5分钟，将其转入2毫米的预冷电转化杯中，迅速电击，电击参数为电压2.5千伏，电击时间为5毫秒，电击后加入900μl冰预冷的SGM17恢复培养基，混匀，将菌液转移至1.5毫升离心管中，冰上放置10分钟，30℃厌氧培养2小时，取适量菌液涂布于含有5μg/ml红霉素的GM17琼脂培养基上，28℃厌氧培养2～3天，由平板上挑取单个菌落，分别接种于含有5μg/ml红霉素的GM17液体培养基中，28℃厌氧培养过夜后，从MG1363中提取质粒；重组质粒进行酶切鉴定及序列测定分析正确的为阳性菌，命名为MG1363/pMG36e-S。