[发明专利]一种检验病原菌群体猝灭基因原核表达产物抗病能力的简易方法

摘要

本发明涉及一种检验病原菌群体猝灭基因原核表达产物抗病效果的简易方法，属于基因功能鉴定技术领域，包括原核表达重组蛋白液的制备、青枯菌液的制备、灌根接种、对照试验等步骤：含病原菌群体猝灭基因的阳性重组菌经过接种、培育、破碎、离心等过程处理后得到原核表达重组蛋白上清液；将青枯菌分离出白色致病菌落，培养后稀释成含菌量108cfu·mL-1的菌悬液；取上述原核表达重组蛋白液青枯菌液混合后，进行灌根接种；以只接种等量青枯菌的桉树苗做对照，混合接种青枯菌与AIIA蛋白的植株形态正常、枝叶挺拔，无明显的感病症状，说明病原菌群体猝灭基因原核表达产物有效降低青枯菌的致病力，延缓植株病症的发生；该检验方法简便，结果准确，实用性强，容易实施。

主权项

一种检验病原菌群体猝灭基因原核表达产物抗病能力的简易方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）原核表达重组蛋白液的制备：取50 μL含病原菌群体猝灭基因的阳性重组菌接种至到5 mL含100 μg·mL‑1 Amp的LB培养液中，160 rpm转速摇菌12 h；然后再取5 μL菌液接种到含100 μg·mL‑1 Amp 5 mL LB培养液中，200rpm转速摇至菌液OD600为0.6~1.0时，加入终浓度为0.4 mmol·L‑1的IPTG，诱导培养9 h，室温下8,000 rpm离心5 min；将离心管中沉淀菌体重悬于预冷的PBS溶液中，用超声破碎法破碎菌体4 min，12,000 rpm离心10 min，取上清液备用；（2）青枯菌液的制备：将青枯菌画线于含放线菌酮1g·L‑1，新霉素2 g·L‑1的TTC 培养基，分离出红色和白色菌落；挑白色致病性青枯菌单菌落于Tm培养基中培养，再将培养液稀释成含菌量108 cfu·mL‑1的菌悬液备用；（3）灌根接种：分别取上述步骤1中的原核表达重组蛋白液与上述步骤2中的青枯菌液各2毫升混合，用尖头镊子伤根处理1月苗龄桉树苗后，在离植株茎基部3‑5cm处土壤中注射上述混合液4mL进行灌根接种，24 h后观察植株病症情况；（4）对照试验：以只接种等量青枯菌的桉树苗做对照，对照植株接种青枯菌24 h后，表现出缺水迹象，植株萎蔫、叶片下垂，浇水不能减轻缺水症状；而混合接种青枯菌与AIIA蛋白的植株形态正常、枝叶挺拔，无明显的感病症状，说明病原菌群体猝灭基因原核表达产物有效降低青枯菌的致病力，延缓植株病症的发生。