[发明专利]睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶基因增强菌株构建及应用

摘要

一种睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶基因增强菌株构建，属于微生物领域。其特征是：重组质粒为pK-Tacpromoter-3，17β-HSD；a.以睾丸酮丛毛单胞菌基因组为模板，通过PCR技术扩增，回收、纯化目的片段后，与pUCm-T载体连接；b.以质粒pAH10为模板，通过PCR技术扩增基因片段，回收、纯化目的片段后，与pUCm-T载体连接；c.采用柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取重组质粒3，17β-HSD-T；d.采用柱式质粒DNA小量抽提试剂盒分别提取重组质粒与pK-3，17β-HSD。有益效果是：首次构建睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-HSD基因增强菌株，并对它进行了应用，对于雌三醇、胆固醇、睾丸酮的降解效率较野生型睾丸酮丛毛单胞菌对于降解效率提高30%、15%和150%。

主权项

一种睾丸酮丛毛单胞菌3，17β‑羟基类固醇脱氢酶基因增强菌株构建，其特征是：重组质粒为pK‑Tac promoter‑3，17β‑HSD；a.以睾丸酮丛毛单胞菌基因组为模板，通过PCR技术扩增3，17β‑HSD基因片段，回收、纯化目的片段后，与pUCm‑T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，采用氨苄青霉素抗性平板筛选获得阳性克隆菌株，测序，比对分析确保获得与模版序列完全匹配的3，17β‑HSD基因重组质粒3，17β‑HSD‑T；b. 以质粒pAH10为模板，通过PCR技术扩增Tac promoter基因片段，回收、纯化目的片段后，与pUCm‑T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，采用氨苄青霉素抗性平板筛选获得阳性克隆菌株，测序，比对分析确保获得与模版序列完全匹配的Tac promoter基因重组质粒Tac promoter‑T；c.采用柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取重组质粒3，17β‑HSD‑T，采用EcoR I与Xba I分别对pK18质粒与3，17β‑HSD‑T质粒进行双酶切，然后分别回收目的片段，在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，构建重组质粒pK‑3，17β‑HSD；d. 采用柱式质粒DNA小量抽提试剂盒分别提取重组质粒Tac promoter‑T与pK‑3，17β‑HSD，采用Sal I与Xho I分别对Tac promoter‑T质粒与pK‑3，17β‑HSD质粒进行双酶切，然后分别回收目的片段，在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，构建基因增强质粒pK‑Tac promoter‑3，17β‑HSD。