[发明专利]猪大肠杆菌与副猪嗜血杆菌弱毒融合菌株的构建方法

摘要

本发明提供了猪大肠杆菌与副猪嗜血杆菌弱毒融合菌株的构建方法，用微生物原生质体融合技术把不同免疫原性的菌株集中于同一菌株上，对血清型多而又无交叉免疫保护的病原菌研制多价疫苗时，有利于提高疫苗中单因子的单位抗原含量，达到提高免疫效果的目的。实验研究证明，融合后新菌株的毒力比亲本菌株的毒力要大大降低，且融合菌株保留了原亲本菌株的抗原特性。这为研制一种新型的猪大肠杆菌—副猪嗜血杆菌二联弱毒苗提供了科学依据与理论指导。

主权项

猪大肠杆菌与副猪嗜血杆菌弱毒融合菌株的构建方法，其特征在于，包括如下具体步骤：1.培养菌株将副猪嗜血杆菌HPS按5%的接种量接种到 TSB液体培养基中，猪大肠杆菌E.coli按5%的接种量接种到普通肉汤中，37℃摇床振荡培养，副猪嗜血杆菌HPS培养12h左右，猪大肠杆菌E.coli培养5h左右，停止培养；2.制备原生质体将步骤1培养的菌株4000r/min离心20min，用0.01mol/L Tris缓冲液离心洗涤菌体2次，再用高渗Tris缓冲液悬浮，副猪嗜血杆菌加入预热的溶菌酶，使其终浓度为0.1mg/mL，37℃水浴 20min，随后缓慢加入0.1mol/L EDTA溶液使其终浓度为0.01mol/L，继续37℃水浴保温15min，4℃ 3500r/min离心后，用SMM悬浮；猪大肠杆菌E.coli加入预热的溶菌酶，使其终浓度为0.2mg/mL，37℃水浴 20min，随后缓慢加入0.1mol/L EDTA溶液使其终浓度为0.01mol/L，继续37℃水浴保温15min，4℃ 3500r/min离心后，用SMM悬浮；3.原生质体融合将步骤2制备的原生质体各取0.1mL混合，然后加入质量浓度为40% 的PEG4000溶液1.8mL，37℃水浴作用90s，立即加入3倍体积的SCM缓冲液稀释，3500r/min离心20min，用SMM悬浮，表面法取样0.1mL加入到含5～10μg/mL的利福平和5～10μg/mL的硫酸阿米卡星的高渗完全选择培养基中，37℃，培养48～72h使融合原生质体再生细胞壁并繁殖，长出融合株菌落。