[发明专利]一种溶剂提取-荧光测定微藻油脂含量的方法

摘要

本发明公开了一种溶剂提取-荧光测定微藻油脂含量的方法，该方法属于微藻粗油脂测定的技术领域。针对现有技术中的荧光测定法直接使用尼罗红荧光染色法染色不够彻底，以及超声或者二甲基亚砜（DMSO）处理-尼罗红染色测荧光的方法测定时藻体叶绿素荧光峰的干扰等缺点，提出本发明的溶剂提取-荧光测定微藻油脂含量的方法。该方法的具体实验步骤是：用微藻配制标准藻液制备标准曲线，提取微藻油脂，然后用荧光测定微藻油脂的含量。在样品的测定过程中，无蒸发有机物的操作步骤，对环境污染较小；所提供的方法具有快速、简便、高效、灵敏、测定结果不受藻样保存期影响的特点。

主权项

一种溶剂提取‑荧光测定微藻油脂含量的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）标准曲线的制作：取微藻，离心后取沉淀，用PBS缓冲液清洗干净，然后用PBS缓冲液稀释成藻液，作为标准藻液；取5份19.8mL标准藻液，分别加入200μL异丙醇、180μL异丙醇+20μL三油精、160μL异丙醇+40μL三油精、140μL异丙醇+60μL三油精、120μL异丙醇+80μL三油精，配制不同浓度的三油精溶液；分别往三油精溶液中依次加入二甲基亚砜和尼罗红染色20分钟，测定各三油精溶液的荧光强度，以吸光度为纵坐标、三油精溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程；二甲基亚砜的体积浓度为20%，尼罗红的浓度为0.3μg/mL；（2）微藻油脂的提取：取干燥的微藻，加入2mol/L KOH‑CH3OH溶液，65℃～85℃水浴加热8～15min，冷却至室温后加入2mol/L HCl‑CH3OH溶液，65℃～85℃水浴加热8～15min，冷却至室温后加入正己烷，静置，分层，取正己烷层，得到待测溶液；每克微藻加入4～8mL2mol/L的KOH‑CH3OH溶液，每克微藻加入8～16mL2mol/L的HCl‑CH3OH溶液，每克微藻加入4～8mL正己烷；（3）荧光测定微藻油脂的含量：将0.2mL步骤（2）制备的待测溶液加入19.8mL步骤（1）制备的标准藻液中，得到样品藻液；将0.2mL正己烷加入19.8mL步骤（1）制备的标准藻液中，得到空白样品；分别往样品藻液、空白样品中依次加入二甲基亚砜和尼罗红染色20分钟，分别测定样品藻液、空白样品的荧光强度，样品藻液的荧光强度减去空白样品的荧光强度，得到待测溶液的荧光强度，由回归方程计算待测溶液中微藻油脂的浓度，计算微藻油脂的含量。