[发明专利]一种简便的细菌基因敲除的方法

摘要

本发明提供了一种细菌基因敲除的方法，包括以下步骤：pSIM19转化E.coliO56，得到含pSIM19的重组E.coliO56；制备含pSIM19的E.coliO56电感受态细胞；以质粒pKD4为模版，PCR扩增带有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段，向电感受态细胞重组菌E.coliO56/pSIM19中加入带有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段；高压电击完成后立即加入SOC液体培养基，培养，筛选得到目的基因已经被消除的阳性重组子。本方法非常简便，省去了诱导剂使用浓度摸索等繁琐的环节。

主权项

一种细菌基因敲除的方法，其特征是，包括以下步骤：(1)pSIM19转化E.coliO56，得到含pSIM19的重组E.coliO56；(2)制备含pSIM19的E.coliO56电感受态细胞：挑取重组E.coli O56的阳性克隆，培养，菌体浓度OD₆₀₀为0.4‑0.5时放入42℃水浴摇床中，震荡摇匀后置于冰上冷却后，离心后，用预冷的无菌三蒸水悬浮菌体，分装至2‑3管预冷的无菌的EP管中；然后用预冷的无菌超纯水水洗EP管中菌体三至五次，最后每管加入无菌水，制备到电感受态细胞E.coliO56/pSIM19；(3)以质粒pKD4为模版，PCR扩增带有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段，向电感受态细胞重组菌E.coli O56/pSIM19中加入所述带有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段；高压电击完成后立即加入SOC液体培养基，37±0.5℃，培养1.5±0.2h后，离心后倒掉部分上清，取适量菌体悬浮液涂布含50±2g/mL的卡那霉素的抗性平板，培养，长出单菌落，将单菌落划线于含50±2g/mL的卡那霉素的抗性平板中，长出较浓菌苔，筛选得到目的基因已经被消除的阳性重组子。