[发明专利]一种离体高效构建多拷贝乳酸克鲁维酵母表达载体的方法

摘要

本发明提出了一种离体高效构建多拷贝的乳酸克鲁维酵母表达载体的方法，步骤为：1）根据乳酸克鲁维酵母KluyveromyceslactisGG799的载体pKLAC2基因序列，设计合成PCR用的10个引物；2）合成四个限制性内切酶位点的酵母表达核式结构的基因片段；3）构建表达载体BpKLAC2；4）用限制性内切酶酶切验证重组载体的正确性；5）在表达载体BpKLAC2上插入目的基因成为含有目的基因的单拷贝表达载体；6）应用生物砖法，离体多拷贝表达载体。应用本发明能够提高乳酸克鲁维酵母表达目的蛋白质基因的表达量和稳定性。

主权项

一种离体高效构建多拷贝的乳酸克鲁维酵母表达载体的方法，其特征在于其步骤为： 1）、设计合成PCR引物；根据商品化的乳酸克鲁维酵母 Kluyveromyces lactis GG799的载体pKLAC2基因序列，设计合成PCR用的10个引物：引物名称序列15'tattacgtaggatcccctaggGCGGGAGTCAGTGGGCCG 3'25'AGTCGATCCTCGCGGGAAATTTAGGAATTTTAAACTTGGGCTTG 3'35'AAATTCCTAAATTTCCCGCGAGGATCGACTCATAAAA 3'45'AAAACATAACGTAACTAAAGGTGTTCACCA 3'55'gcggccgcAAGCAGCAGATTACGCGCAGAA 3'65'gaattccggaccgAATTTCAGGTGGCACTTTTCGG 3'75'CTGAAATTCGGTCCGGAATTCCCTGCAGGTAATTAAATAAAGGCCTTG 385'tattgtacagtcgacactagtCCCGGAAACAACAAAAGGATGAT 3'2)、合成四个限制性内切酶位点的酵母表达核式结构的基因片段；分别用引物1和2、3和4、7和8为引物，pKLAC2质粒为模板，PCR合成片段a、b、d，用琼脂糖凝胶电泳回收；再以引物1和4为上下游引物，将DNA片段a、b按1:1比例为模板，PCR合成大片段AB，以引物5和6为引物，pET30a质粒为模板，PCR合成片段c，用琼脂糖凝胶电泳回收；以引物5和8为上下游引物，将DNA片段c和d按1:1比例为模板，PCR合成大片段CD、DNA片段AB和CD琼脂糖凝胶电泳回收备用；以上PCR条件为98℃，2min，1 cycle; 98℃，7s，55℃，30s，72℃，1min, 30cycle；72℃，8min, 1 cycle；4℃保存；3）、构建表达载体BpKLAC2；用限制性内切酶SnaBⅠ酶切载体pKLAC2和第2步的片段AB，3h，然后电泳检测，酶切完全后琼脂糖凝胶回收；再将产物用限制性内切酶HindⅢ 酶切3h，琼脂糖凝胶电泳回收；将经两步酶切后所得片段和载体按3:1比例混合，用TAKARA公司的连接试剂盒SolutionⅠ连接酶酶连2h，常规转化入大肠杆菌感受态细胞DH10β，涂布含氨苄西林钠的LB平板，37℃培养12h；随机挑选菌落，抽质粒，以此为模板，采用PCR的方式筛选重组质粒；以引物1和4为引物PCR，鉴定重组阳性克隆，命名Bp‑lac4；用限制性内切酶NotⅠ酶切载体Bp‑lac4和片段CD，琼脂糖凝胶电泳回收后将所得产物用限制性内切酶BsrGⅠ酶切3h，琼脂糖凝胶电泳回收后得到所需载体和片段，按照载体：片段=1:3的比例用SolutionⅠ连接酶酶连2h，常规转化入大肠杆菌感受态细胞DH10β，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃培养12h，长出菌落以引物5和6、经PCR验证全为所需阳性克隆，将该重组载体命名为BpKLAC2；以上PCR条件为98℃，2min，1 cycle; 98℃，7s，55℃，30s，72℃，1min, 30cycle；72℃，8min, 1 cycle；4℃保存；4）、用限制性内切酶酶切验证重组载体的正确性；5）、在表达载体BpKLAC2上插入目的基因成为含有目的基因的单拷贝表达载体；6）、应用生物砖法，离体多拷贝表达载体。