[发明专利]一种肝素活性的测定方法

摘要

本发明公开一种肝素活性的测定方法，包括标准品与样品处理，标准曲线制定及样品测定，样品肝素活性含量计算三步；其反应体系及时间：①10～40μl肝素活性浓度为0～0.1IU/ml的标准曲线制定溶液及样品与10～40μl浓度为1IU/ml的抗凝血酶混合，37℃孵育3分钟；②加入10～40μl浓度为10nkat/ml活化的牛凝血因子Ⅹ，混合后37℃孵育1.5分钟；③加入10～40μl浓度为2.5mmol/L发色底物S-2765，混合后37℃孵育3分钟；④加入10～40μl体积浓度为50%的乙酸，混合均匀终止反应；试剂使用微量，检测效率高，测定结果精准度高，更适应于较低肝素活性样品的检测。

主权项

1.一种肝素活性的测定方法，其特征在于其操作过程、反应体系及时间具体为：①标准品与样品的处理0.02mol/L，pH8.4的Tris缓冲液梯度稀释肝素标准品至肝素活性浓度范围在0~0.1IU/ml之间；取4种或4种以上梯度活性浓度来制定标准曲线；待测样品如需稀释，同样用0.02mol/L，pH8.4的Tris缓冲液稀释至肝素活性浓度为0~0.1IU/ml；②标准曲线制定及样品测定a．10~40μl等体积的已稀释的标准曲线制定溶液及样品同时加入微孔板不同孔中；b．每孔同时加入10~40μl等体积的1IU/ml抗凝血酶溶液，混合均匀，37℃孵育3分钟；c．每孔同时加入10~40μl等体积活化的牛凝血因子Ⅹ溶液，其浓度为10nkat/ml，混合均匀，37℃孵育1.5分钟；d．每孔同时加入10~40μl等体积发色底物N-α-苄氧羰基-D-精氨酰-L-甘氨酰-L-精氨酸-P-硝基苯胺的盐酸盐，N-α-Z-D-Arg-gly-Arg-pNAHCl即S-2765溶液，其浓度为2.5mmol/L，混合均匀，37℃孵育3分钟；e．每孔同时加入10~40μl等体积的体积浓度为50%的乙酸，混合均匀终止反应；f．10~40μl对应的标准曲线制定溶液或待测样品与4倍体积超纯水混合后作空白对照；g．微孔板直接在酶标仪上于405nm波长读取吸光值；h．根据肝素标准品梯度浓度与所对应吸光值，采用线性方程绘制标准曲线；③样品肝素活性含量计算依据标准曲线和样品反应物所对应的吸光值，计算肝素活性含量。