[发明专利]一种离体高效构建多拷贝毕赤酵母表达载体的方法

摘要

本发明提出了一种离体高效构建多拷贝毕赤酵母表达载体的方法，其步骤为：1）在pPIC9K表达载体的基础上，构建载体pHBM905A；2）构建重组载体pHBM905BDM；3）选择需表达的外源基因蛋白；4）构建含有外源基因蛋白的单拷贝重组载体pHBM905BDM-gene-1；5）基于Biobrick方法，构建了人工体外串联重复表达盒式结构多拷贝的新载体pHBM905BDM-gene-n。本发明基于对pPIC9K表达载体的一系列改造，构建了适合于离体构建多拷贝的重组载体pHBM905BDM；进一步实现了构建含有外源基因的单拷贝重组载体pHBM905BDM-gene-1和多拷贝重组载体pHBM905BDM-gene-n。这些高拷贝的重组质粒只是在测序正确的1拷贝的基础上酶切酶连得到，无需再测序，这样就可以节约成本，省时省力，同时大大提高了外源基因蛋白表达能力。

主权项

1.一种离体高效构建多拷贝毕赤酵母表达载体的方法，其特征在于步骤为：1）.构建载体pHBM905A首先在原始的毕赤酵母表达载体pPIC9K的基础上，设计以下引物分别扩增不同的片段，按照表1的引物扩增对应的片段，然后利用overlapping PCR方法，将1,2,3片段套叠一个大片段并命名为A ，将4,5,6片段套叠一个大片段并命名为B；A,B片段都经过Dpn I处理消化模板后，用胶回收试剂盒回收纯化后，将片段A和片段B按照1:1混合，转化大肠杆菌表1DH10β感受态细胞，过夜培养，待平板上长出明显菌落时，挑选转化菌落，小量提取质粒，分别进行测序鉴定，测序正确的重组子就命名为载体pHBM905A；2）.构建重组载体pHBM905BDM   a）采用常规基因工程方法合成d1+2×201 AOX1启动子突变体片段、MF4I-SS信号肽序列4I-MF片段、kana+3’AOX1（TT）”片段；b）用overlapping的方法将d1+2×201 AOX1，4I-MF，“kana+3’AOX1（TT）” 套叠成一个大片段，大约2.9kb左右，用凝胶回收试剂盒对此PCR产物进行凝胶回收，并命名为1片段；c）用反扩的方法扩增载体骨架以pHBM905A为模板，用引物对AMP-F、AMP-R扩增得到6kb左右的片段，用凝胶回收试剂盒对此PCR产物进行凝胶回收，并命名为2片段；d）将这1片段和2片段用Dpn I消化处理2小时，再对这2个片段进行溶液回收纯化后，将这两个片段以1:1的体积混合转化大肠杆菌DH10β感受态细胞，过夜培养，待平板上长出明显菌落时，挑选转化菌落，小量提取质粒，分别进行测序鉴定，测序正确者，即可得到目标载体pHBM905BDM；3）.选择需表达的外源基因蛋白gene；4）.构建含有外源基因蛋白的单拷贝重组载体pHBM905BDM-gene-15）.基于Biobrick方法，构建了人工体外串联重复表达盒式结构多拷贝的新载体pHBM905BDM-gene-n。