[发明专利]一种四环素产生菌原生质体的制备与再生方法

摘要

本发明的目的就是提供一种四环素产生菌原生质体的制备、再生方法。它包括如下步骤：a、制备四环素斜面培养基；b、制备孢子悬浮液；c、制备菌丝体培养基；d、制备再生培养基；e、培养菌丝体；f、酶解细胞壁；g、分离原生质体；h、原生质体再生。本发明提供的四环素菌种选育的新方法，解决了四环素原生质体菌落无法再生和产孢子能力低、不能传代的问题。

主权项

一种四环素产生菌原生质体的制备与再生方法，其特征在于它包括如下步骤： a、制备四环素斜面培养基：称取小麦麸皮3.0‑3.5g，硫酸镁0.004‑0.006g，磷酸氢二钾0.01‑0.12g，磷酸氢二铵0.013‑0.015g，琼脂粉1.3‑1.5g，加蒸馏水至100ml；120‑124℃条件下湿热灭菌30分钟；斜面培养基装量60ml/茄子瓶； b、制备孢子悬浮液：将四环素产生菌接种于斜面培养基上，于33‑36℃条件下培养96小时左右，长出斜面孢子；在无菌条件下加入无菌蒸馏水或菌丝体培养基制成孢子悬浮液，使孢子悬浮液浓度在1×108/ml以上； c、制备菌丝体培养基：称取葡萄糖0.8‑1.2g，蛋白胨0.3‑0.5g，酵母膏0.3‑0.5g，磷酸二氢钾0.1‑0.2g，硫酸镁0.03‑0.05g，磷酸氢二钾0.3‑0.4g，甘氨酸0.2‑1g，加水至100ml；120‑124℃条件下湿热灭菌30分钟； d、制备再生培养基：称取面粉2‑4g，蛋白胨0.3‑0.5g，磷酸二氢钾0.05‑0.10g，碳酸钙0.1‑0.4g，蔗糖0‑11g，琼脂1.5‑2.5g加水至100ml；120‑124℃条件下湿热灭菌30分钟后制成平板培养基； e、培养菌丝体： 将四环素孢子悬浮液接种于c步骤所述菌丝体培养基中，在27℃‑33℃条件下，震荡培养22‑32小时，离心弃去上清液，得到菌丝体； f、酶解细胞壁： 将e步骤所得菌丝体加入稳定液，离心洗涤2‑4次，加入溶菌酶溶液，使溶菌酶作用浓度为2mg/ml‑6mg/ml，30℃‑37℃酶解1‑3小时，得到酶解液； g、分离原生质体： 酶解液经离心去除沉淀，然后再将上清液离心，获得原生质体； h、原生质体再生： 将g步骤所得的原生质体用稳定液离心洗涤2‑4次后，加入稳定液制成原生质体悬浮液，原生质体悬浮液用稳定液稀释，采用夹层法培养于再生培养基上，于33℃‑36℃条件下培养5‑7天，形成再生菌落。