[发明专利]一种甲醇蛋白肽的生产方法

摘要

本发明涉及甲醇蛋白肽的生产方法，有效解决单细胞蛋白作为饲料添加剂后，出现消化不良、转化效率低的问题，巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株接种至YPD斜面培养基上，得试管斜面种子，试管斜面种子接种到YPD液体培养基上，得摇瓶一级种子，摇瓶一级种子接种到BSM液体培养基上，得二级种子，二级种子移种到发酵培养基中发酵得发酵液，灭活后过滤收集滤饼，加水稀释得滤饼稀释液，蛋白酶粉加水溶解，倒入滤饼稀释液中酶解，得酶解液，灭活，过滤，收集滤液、滤饼，回流再次酶解，收集压滤酶解液，超滤浓缩，加淀粉搅拌，喷雾干燥，本发明具有蛋白肽含量高，氨基酸组成合理，B族维生素丰富的特点，可作为替代畜禽饲料蛋白的理想原料。

主权项

一种甲醇蛋白肽的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：1）、摇瓶一级种子培养分类命名为巴斯德毕赤酵母HGD‑01的菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2012342；将巴斯德毕赤酵母HGD‑01的菌株 0.5mL用划线法接种至YPD试管斜面培养基上，30℃培养48小时，得试管斜面种子，取1支试管斜面种子，用10mL无菌水将斜面种子全部冲洗下来，接种到装有300mL YPD液体培养基的三角瓶中，瓶口用8层纱布包好，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养24～30小时后，菌体OD600达到3～5，获得摇瓶一级种子；所述的YPD试管斜面培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂和余量的水混合在一起组成；所述的YPD液体培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起组成； 2）、二级种子培养二级种子培养在50L发酵罐中进行，具体如下：50L发酵罐装30L的BSM液体培养基，BSM液体培养基灭菌后，用氨水调BSM液体培养基pH值至4.5～5.0，然后将摇瓶一级种子300mL全部接种到50L发酵罐内pH值为4.5～5.0的BSM液体培养基上，接种时罐压为0.05‑0.10MPa，培养时，培养温度30～32℃，通风比1：1~1.5 vvm，罐压0.05MPa，pH4.5～5.0，培养周期24~30h，得二级种子；所述的BSM液体培养基为：质量浓度85%磷酸15mL/L，二水硫酸钙0.4g/L，硫酸钾8 g/L，七水硫酸镁6 g/L，甘油36g/L和微量元素溶液3 mL/L加水制成，也就是说BSM液体培养基为质量浓度85%磷酸15mL，二水硫酸钙0.4g，硫酸钾8 g，七水硫酸镁6 g，甘油36g和微量元素溶液3 mL加水至1 L；所述的微量元素溶液为：五水硫酸铜14g/L，碘化钾0.08g/L，一水硫酸锰4g/L，二水钼酸钠0.1g/L，硼酸0.1g/L，六水合氯化钴1g/L，氯化锌36g/L、七水合硫酸亚铁65g/L和质量浓度为98%的浓硫酸5mL/L加水制成，也就是说微量元素溶液为五水硫酸铜14g，碘化钾0.08g，一水硫酸锰4g，二水钼酸钠0.1g，硼酸0.1g，六水合氯化钴1g，氯化锌36g、七水合硫酸亚铁65g和质量浓度为98%的浓硫酸5mL加水至/L；3）、发酵生产甲醇蛋白A、发酵培养基的配方和比例与上述BSM液体培养基相同：5m3发酵罐内装发酵培养基3m3，打开蒸汽阀，通蒸汽进入罐体外盘管及罐体内，用蒸汽将发酵罐中发酵培养基进行灭菌，打开压力表，待罐内压力升到0.15MPa时，调节蒸汽阀门使罐体温度保持在120℃～125℃，保温30min，同时对与罐体连接的空气过滤器进行蒸汽灭菌，灭菌结束后，对发酵培养基进行降温，当罐内发酵培养基温度降至30～35℃时，用质量浓度为35%的氨水调节发酵培养基pH至4.5～5.0；B、将二级种子30L移种到5m3发酵罐内pH为4.5～5.0的发酵培养基中开始发酵，发酵温度30～32℃，通风比1：1.5~2 vvm，罐压0.04MPa，pH4.5～5.0，培养16~20h，罐内菌体OD600达到32～35，湿重达到80～100g/L，向罐内流加甲醇，甲醇流加量为5～6克/升·小时，打开空气进口阀门，保持罐内溶氧在30%以上，当溶氧高于60%以上时，加大甲醇流加量，最大流加量达到10～15克/升·小时，发酵过程中，每12小时补加一次微量元素溶液，每次流加2升，直至发酵结束，发酵72～84小时后，菌体湿重达300～360g/L，得发酵液；用蒸汽对罐内发酵液进行灭活处理，发酵液温度达100℃，保温时间30min后，对发酵液降温至60℃～65℃；4）、单细胞菌体蛋白的收集与酶解降温至60℃～65℃的发酵液用箱式隔膜压滤机过滤，板框过滤面积30m2，过滤流速0.5～1.5m3/h，板框工作压力0.3～0.5MPa，过滤完成后，将箱式隔膜压滤机上的滤饼清洗下来，投加到5m3的发酵液储罐中，向罐中加入清水将滤饼稀释，清水和滤饼的体积比为3：1，搅拌均匀，得菌体蛋白稀释液，用向外盘管输入热蒸汽或冷水方式将菌体蛋白稀释液温度调整到45～50℃，然后称取蛋白酶粉用水溶解，得蛋白酶溶液，以每立方米菌体蛋白稀释液中添加5Kg蛋白酶粉的量，将蛋白酶溶液倒入2m3菌体蛋白稀释液中并搅拌均匀，在45～50℃，酶解，当水解度达75%以上时，得酶解液，打开蒸汽阀门，对罐内酶解液中的蛋白酶进行灭活，罐内温度达100℃，保温时间20min；5）、酶解液的板框压滤及甲醇蛋白肽的提取将上述酶解液经箱式隔膜压滤机过滤，收集滤液和滤饼，滤液和滤饼再回收到步骤4）中的5m3发酵液储罐内用步骤4）同样的方法和用量进行酶解，得压滤酶解液；压滤酶解液用超滤膜进行浓缩，超滤膜面积22m2，过滤压力0.6MPa，温度30℃，得浓缩液，浓缩液中为截获的分子量在5000Da以上的小分子蛋白肽；6）、浓缩液喷雾干燥在浓缩液中添加浓缩液体积5%的淀粉并搅拌均匀，用喷雾干燥机，进行喷雾干燥，调节进口温度至130～150℃、出口温度至65‑80℃，调节进料流量为0.5吨/小时，收集蛋白肽干粉。