[发明专利]一种植物双基因共表达载体的构建方法

摘要

本发明涉及一种植物双基因共表达载体的构建方法，其特征在于通过PCR扩增将质粒pGWB605(GenBank登记号AB543114)中的间隔序列两端添加Ncol和EcoR I内切酶酶切位点后，将间隔序列克隆入pXCS-HAStrep质粒中，构建了植物双基因共表达载体pXCS-Dgene-HAStrep。该表达载体自身仅有5682Kb，可装载两个较大的外源基因，而且两个外源基因能在一套真核表达系统中独立表达。该表达载体采用bar基因做筛选标记基因，转基因植株的筛选操作简单，效率高。

主权项

一种植物双基因共表达载体的构建方法，其特征在于包括：1)设计引物a.根据待扩增的间隔序列，设计引物，SP‑F和SP‑R，并在上游引物和下游引物中分别引入Ncol和EcoR I内切酶酶切位点；b.根据pXCS‑HAStrep载体多克隆位点结构特点，设计接头SP‑A1和SP‑A2；2)载体构建a.以载体pGWB605(GenBank登记号AB543114)为模板，SP‑F/SP‑R为引物，通过PCR扩增获取间隔序列，产物大小为341bp；b.将扩增产物与pMD‑19T载体在16℃连接过夜，次日转化大肠杆菌DH5a,涂布于含抗生素Carb的LB固体培养基上，37℃培养12h，挑取阳性单克隆，提取质粒进行测序；c.用内切酶Hind III和EcoR I酶解质粒pXCS‑HAStrep，回收大片段并与接头SP‑A1/SP‑A2连接；d.对步骤b中测序正确的阳性克隆提取质粒pMD‑19T，用Ncol和EcoR I酶解质粒pMD‑19T，回收间隔序列,并与步骤c中的连接产物进行连接；e.连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑取阳性单克隆，提取质粒，所得质粒即为植物双基因共表达载体pXCS‑Dgene‑HAStrep。