[发明专利]牛混合羊精液体外受精新方法

摘要

一种牛混合羊精液体外受精的新方法，属于动物繁殖技术领域，将COCs分别用牛卵母细胞捡卵液、牛卵母细胞成熟液洗后，放入牛卵母细胞成熟液中成熟培养，在BO-AB液中洗后，放入牛羊原精混合的精子滴中培养；再用SOF液脱掉颗粒细胞，把脱掉颗粒细胞的卵子放入SOF液中培养。本发明的优点是利用异种动物不交叉受精的生殖隔离的受精生物学原理，牛羊原精混合，进行牛卵子体外受精处理；通过羊精子推流作用，促进低于正常受精所需的牛精子和卵子受精，达到制作牛胚胎的目的。

主权项

一种牛混合羊精液体外受精新方法，其特征在于：按如下的步骤进行：（一）、配制试剂：（1)配制牛卵母细胞捡卵液：H‑M199+10%FBS4℃保存，使用期限为一个月;（2）配置牛卵母细胞成熟液:M199+1µg/mlE2+0.1IU/mlFSH+1IU/mlLH+10%FBS4℃保存，使用期限为一个月; （3）配制牛体外受精液BO液：使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;（4）配制BO‑A受精液：使用BO液进行溶解，现配现用;（5）配制BO‑B受精液：使用BO液进行溶解，现配现用;（6）配制BO‑AB受精液：等量BO‑A与BO‑B混合,现配现用;（7）配制牛体外受精培养液Stock A液：名称浓度Nacl 997.6mMKcl 71.63mMKH2PO411.90mMMgcl2·6H204.919mMNa‑lactate0.616  (V/V)%Glucose14.99mM使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;（8）配制牛体外受精培养液Stock B液：名称浓度NaHCO3250.0mM使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;（9）配制牛体外受精培养液Stock C液：名称浓度Na Pyrucate32.72mM使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;（10）配制牛体外受精培养液Stock D液：名称浓度Cacl2·2H2O171.4mM使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;（11）配制牛体外受精培养液Stock X液：名称浓度L‑Glutamine99.90mM使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;（12）配制牛体外受精培养液Stock Y液：名称浓度Sodium citrate34.00mM使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;（13）配制牛体外受精培养液Stock Z液：名称浓度myo‑Inositol277.0mM使用超纯水进行溶解，4℃保存，使用期限为一个月;（14）配制牛体外受精培养液IVC SOF液： SOF液体总体积10mlstockA1mlstockB1mlstockC100µlstockD100µlstockX100µlstockY100µlstockZ100µlNEAA100µlEAA200µlBSA0.08gP/S10µl酚红10µl超纯水7.18ml4℃保存，使用期限为一个月;（二）、体外受精：（1）牛卵细胞的成熟培养：①屠宰3h之内的新鲜牛卵巢用无菌生理盐水冲洗3次并浸泡在干净的生理盐水中,用20ml注射器17#针头抽取直径在2‑8mm的卵泡，将采集后的卵泡液放在10cm培养皿中，在显微镜下捡出卵丘‑卵母细胞复合体COCs；②把牛卵母细胞捡卵液与牛卵母细胞成熟液放在38.5℃，5%的二氧化碳培养箱中平衡1h以上，然后将拣出的卵丘‑卵母细胞复合体COCs用平衡好的牛卵母细胞捡卵液洗一遍，再用牛卵母细胞成熟液洗两遍后，取一四孔板，每孔先加入500µl牛卵母细胞成熟液，再加入500µl石蜡油，按照每孔50‑120枚的数目放入牛卵母细胞成熟液中，在38.5℃，5%二氧化碳培养箱内进行成熟培养22h；（２）体外受精：①取50ml烧杯两个，分别标记为A和B：A配制牛体外受精液BO‑A液，B配制牛体外受精液BO‑B液；配置好的牛体外受精液BO‑A液和BO‑B液分别用0.2μm滤器过滤到新的50ml烧杯中，均放入37.5℃恒温水浴锅中预热；②取牛、羊原精混合，加入5ml预热的牛体外受精液BO‑A液，轻轻将混合精液混匀后，2000rpm/min室温离心5min，弃上清；再加入5ml预热的牛体外受精液 BO‑A液，轻轻混匀后，2000rpm/min离心5min，弃掉上清后，用预热的牛体外受精液BO‑AB液将牛羊混合精子浓度稀释为1000万/ml；③用②处理好的精液在35mm皿中做100µl的精子滴，做好后加入石蜡油放入38.5℃，5%二氧化碳培养箱中；④打开显微镜保温板升至37.5℃，在显微镜下拣出成熟22h的牛卵细胞，在预热的牛体外受精液BO‑AB液中洗3次，将③中做好的精子滴从培养箱中拿出，每个精子滴加入10枚卵，38.5℃，5%二氧化碳培养箱中培养6h；（３）受精卵的体外发育培养：受精6h后，用培养箱中预热的牛体外受精培养液IVC SOF液脱掉颗粒细胞，然后，把脱掉颗粒细胞的卵子放入预热的每孔含500µl牛体外受精培养液IVC SOF液，上盖500µl石蜡油的四孔板中，38.5℃，5%二氧化碳培养箱继续培养。