[发明专利]一种抗氧化活性肽及其制备方法

摘要

本发明公开了一种抗氧化活性肽及其制备方法，其特征在于以蓝圆鲹鱼肉蛋白为原料，采用枯草杆菌2709产生的碱性蛋白酶水解，水解液灭酶后经离心、超滤、凝胶层析和反相高效液相色谱等分离并确定其中两种天然抗氧化肽的结构，其氨基酸序列分别为His-Asp-His-Pro-Val-Cys(组氨酸-天冬氨酸-组氨酸-脯氨酸-缬氨酸-半胱氨酸)和His-Glu-Lys-Val-Cys(组氨酸-谷氨酸-赖氨酸-缬氨酸-半胱氨酸)，其清除50％DPPH·自由基所需浓度(EC50)分别为0.0310±0.0011μM和0.0677±0.0012μM，清除50％超氧阴离子(O2-·)自由基所需浓度(EC50)分别为0.3814±0.0017μM和0.3744±0.0021μM，具有良好的抗氧化活性。

主权项

一种制备蓝圆鲹鱼肉蛋白抗氧化活性肽的方法，其特征在于以蓝圆鲹鱼肉蛋白为原料，采用枯草芽孢杆菌2709所产生的碱性蛋白酶水解，具体工艺为：(1)将蓝圆鲹鱼肉蛋白粉与水混合调成蛋白含量为1～5wt％的反应原料液，然后加入0.002～0.05wt％碱性蛋白酶，在45～60℃及pH为7.5～10下水解3～6小时，最后加热至100℃灭酶得到酶解液；(2)将酶解液于4℃、8000r/min离心10～15min，得到上清液并使用分子量为5000Da的超滤膜超滤分离收集渗透液；(3)以去离子水为流动相采用Sephedex G‑15凝胶层析柱分离步骤2得到的渗透液，并用蛋白核酸检测仪于280nm处检测并测定各峰对应的洗脱液的抗氧化活性，收集高活性的2号吸收峰(见图1)组分并冻干得到冻干体；(4)将步骤3得到的冻干体用反相HPLC进一步分离，使用ODS柱(Hedera ODS‑C2，10×250mm)，采用含0.1％三氟乙酸的水和乙腈(0～25～60min内0～21～50％乙腈)为流动相线性洗脱，220nm波长下检测洗脱峰并收集测定各峰抗氧化活性，流速1.5mL·min‑1，根据检测谱图(见图2)收集活性最高的1号吸收峰对应的洗脱液；然后改用C18柱(Hypersil ODS‑C18，4.6×250mm)对1号吸收峰洗脱液进行再次纯化，洗脱梯度为40min内0～20％乙腈，流速0.5mL·min‑1，根据检测谱图(见图3)分别收集较高活性的1号和2号吸收峰对应的洗脱液并冷冻干燥，即得二个抗氧化肽。