[发明专利]一种黑芥小孢子培养获得再生植株的方法

摘要

本发明公开了一种黑芥小孢子培养获得再生植株的方法，属于植物组织培养技术领域。方法包括：（1）培养基的配制；（2）供体植株、花蕾的选择与预处理；（3）小孢子胚状体的诱导培养；（4）再生植株的分化与萌发培养；（5）再生植株的生根培养与移栽；（6）再生植株的倍性检测等步骤。本发明对黑芥的小孢子进行培养，其出胚率最高达15个胚/蕾，出苗率平均达50%，能批量获得遗传上纯合、表现型一致的双单倍体再生植株材料。本发明可在黑芥育种、遗传图谱、抗性基因定位、克隆及转基因等研究领域中推广应用。

主权项

一种黑芥小孢子培养获得再生植株的方法，其特征在于按如下步骤进行：  （1）培养基的配制：包括小孢子培养各阶段的培养基，它们的组分与各组分在每升培养基中的重量为：1）胚状体诱导培养基：NLN‑13液体培养基 + 蔗糖130 g/L，pH 5.6~6.0，过滤灭菌；2）胚状体分化培养基：B5培养基+ ZT 0.5~2.0 mg/L + NAA 0.01~0.1 mg/L + BAP 0.5~2.0 mg/L + 蔗糖20~30 g/L + 琼脂7~9 g/L，pH 5.6~6.0，高温灭菌；3）萌发、生根培养基：MS培养基 + NAA 0.05~0.1 mg/L + 蔗糖30 g/L + 琼脂8 g/L，pH 5.8，高温灭菌；（2）供体植株、花蕾的选择与预处理：    1）供体植株、花蕾的选择：选择生长健康的黑芥作为供体植株；并从中选择花瓣与花药长度比在0.7~1.0之间，处于单核中晚期的花蕾为供体花蕾；2）花蕾灭菌：先用纯净水清洗花蕾3次后，将其放入由0.1% HgCl2 + 0.1%吐温20配成的灭菌液中，摇床按50‑80 rpm轻微摇晃12分钟进行表面消毒后，再在超净台上用无菌水清洗4次，备用；3）花蕾小孢子的分离、混配与分装：在超净台上将灭菌后花蕾置于无菌烧杯中，加入1 mL胚状体诱导培养基后用平头玻棒压碎花蕾、再加入9 mL相同培养基并搅成悬浮液；用40 µm无菌尼龙滤网过滤于离心管中，1000rpm离心4分钟，弃上清液；加入胚状体诱导培养基至平均每4mL培养基中含1.0个花蕾所含的小孢子量后，再将该液中的培养基与由NLN‑13液体培养基 + 1g/L活性炭、经高温灭菌的活性炭混合液按体积0.05 mL∕4mL比例混配成小孢子悬浮液；并分装于直径为6 cm的无菌培养皿中，加盖后用parafilm膜封口，备用；（3）小孢子胚状体的诱导培养：将上述培养皿置于31‑33℃培养箱中，暗培养24‑48小时；后置于25℃恒温培养箱中，暗培养15‑20天至胚状体出现；再在25℃黑暗下50rpm振荡培养7‑10天，至子叶胚状体形成；    （4）再生植株的分化与萌发培养：将子叶胚状体平放于胚状体分化培养基上，25℃每天光照16小时培养15~20天至胚状体膨大并再生出新植株；（5）再生植株的生根培养与移栽：切取萌发有正常生长点的再生植株插于生根培养基中，25℃每天光照16小时培养至生根；将生根再生植株移入由泥炭与珍珠岩按体积2：1配制的基质中，浇透水，覆盖塑料膜后在25℃下培养1周；（6）再生植株的倍性检测：取移栽成活再生植株的嫩叶，用德国Partec公司生产的partec PA倍性分析仪检测该再生植株的DNA倍性。