[发明专利]一种检测甘蔗黄锈病菌的实时荧光定量PCR方法

摘要

本发明涉及一种检测甘蔗黄锈病菌的实时荧光定量PCR方法，包括基因组DNA提取、实时荧光定量PCR检测体系建立、实验有效性判定以及实时荧光定量PCR检测。本发明的一种检测甘蔗黄锈病菌的实时荧光定量PCR方法，具有灵敏度高，特异性好，所需要的DNA用量少的特点；与常规的根据病菌培养后的孢子形态特征鉴定、根据田间种植后病害表型症状鉴定以及常规PCR检测技术相比，具有灵敏度高，特异性好，样品消耗少，还能实时直观地监测PCR扩增过程等优点。为甘蔗黄锈病菌的鉴定，提供了高灵敏度、特异性强的快速检测体系，可用于田间甘蔗黄锈病菌的早期诊断及检测，对抗黄锈病甘蔗育种和抗黄锈病甘蔗种质资源的保护具有重要的意义。

主权项

一种检测甘蔗黄锈病菌的实时荧光定量PCR方法，包括基因组DNA提取、实时荧光定量PCR检测体系建立、实验有效性判定以及实时荧光定量PCR检测，其特征在于： （1）实时荧光定量PCR检测体系的建立：实时荧光定量PCR扩增体系总体积为25 μl，内含12.5 μL 2×TaqMan Universal Master Mix，10 μmol/L的检测引物qPCR‑F和qPCR‑R各0.75 μL，0.4 μL 10 μmol/L探针，5‑10 ng基因组DNA，ddH2O补足到25 μl； PCR扩增程序如下：50 ℃ 2 min，94 ℃ 10 min；90 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环，在60 ℃进行单点荧光检测；所述检测引物和探针如下：  qPCR‑F：5'‑ TAACAATGGATCTCTAGGC ‑3'；qPCR‑R：5'‑ GTTAATAATGAGGTTTCCC ‑3′；探针：5'‑ FAM‑TATAACATTATCCCC‑TAMRA‑3′；（2）实验有效性判定同时具备a、b、c三个条件的实验为有效实验，否则为无效实验；所述a、b、c三个条件如下：a、空白对照，无Ct值且无典型的扩增曲线；b、阴性对照，无Ct值且无典型的扩增曲线；c、阳性对照的Ct值≤30.0，并出现典型的扩增曲线；所述典型的扩增曲线为S型动力学曲线；阈值线为以阴性对照样品扩增曲线的最高点为基准，与横坐标平行的一条直线；阈值线和典型的扩增曲线的交点所对应的定量PCR扩增循环数为Ct值；阳性对照为已知含甘蔗黄锈病菌的样品；阴性对照为已知不含甘蔗黄锈病菌的样品；空白对照指用等体积的无菌ddH2O代替模板DNA；（3）实时荧光定量PCR检测实时荧光定量PCR检测中，样品检测结果如下：A、无Ct值且无典型的扩增曲线，表示样品中不含甘蔗黄锈病菌；B、Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含甘蔗黄锈病菌；C、当Ct值＞35.0，则该样品做重复实验；重复实验结果无Ct值则该样品中不含甘蔗黄锈病菌；若重复实验结果有Ct值且有典型的扩增曲线，则该样品中含甘蔗黄锈病菌。