[发明专利]一种油菜种子携带油菜黑胫病病原菌的分子检测方法

摘要

本发明公开了一种油菜种子携带油菜黑胫病病原菌的分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)带菌种子的制备；2)取相同数量的带菌种子提取DNA，用RAPD检测经不同处理所得带菌种子的DNA质量；3)从不同带菌率的油菜种子中提取目的病原菌DNA；4)DNA的微量提取；5)模板浓度梯度检测；6)不同带菌率带菌种子DNA的提取；7)PCR扩增不同带菌率带菌种子的DNA。该方法的精确度达到2‰准确率。

主权项

一种油菜种子携带油菜黑胫病病原菌的分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)带菌种子的制备：用高压灭菌、经1％NaCLO表面消毒及未经任何处理的种子制备不同带菌率的带菌种子；2)取相同数量的带菌种子提取DNA，用RAPD检测经不同处理所得带菌种子的DNA质量；3)DNA大量提取：从不同带菌率的油菜种子中用CTAB法提取目的病原菌DNA；4)DNA微量提取：取100ul经CTAB法大量提取后所得DNA再用QIAGEN试剂盒进行微量提取；5)模板浓度梯度检测：50ul的扩增体系中加10ul模板较理想；6)扩增反应体系：采用ITS引物对病菌rDNA的ITS片段进行扩增，引物序列为：ITS1(5′‑CTTGCCCACCAATTGGATCCCCTA‑3′)和ITS2(5′‑GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG‑3′)，50uL PCR反应体系为，5uL10×PCR buffer，0.2mM dNTP，ITS1和ITS2引物各1μM，0.1UTaq酶，10uL模板DNA，17.5uL ddH2O，PCR反应程序为：94℃，2min94℃，30s；58℃，30s；72℃，1min；44个循环；72℃，5min；8℃5min；7)不同带菌率带菌种子DNA的提取：先用步骤3)的提取方法然后再用步骤4)的提取方法；8)PCR检测不同带菌率带菌种子DNA。