[发明专利]一种筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法

摘要

本发明公开了一种筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法，采用构建目标基因的敲除质粒和携带I-SceI基因的诱导质粒，通过接合转移导入嗜酸性氧化硫硫杆菌中，使用抗性标记筛选单交换子，使用蓝白筛选初筛双交换子。本发明首次建立了嗜酸性氧化硫硫杆菌的无标记基因敲除方法，首次将β-半乳糖苷酶蓝白筛选应用于双交换子的筛选，不仅能快速、稳定、高效地敲除目标基因，而且克服了已有无标记基因敲除流程中因缺少选择压力造成的筛选困难这一瓶颈，缩短了双交换子筛选时间、提高了筛选效率、减少了筛选成本，为嗜酸性氧化硫硫杆菌稳定的遗传改造提供了便利的新方法。

主权项

一种筛选嗜酸性氧化硫硫杆菌无标记基因敲除菌株的方法，步骤包括：（1）构建含有大肠杆菌β‑半乳糖苷酶基因lacZ、酵母核酸内切酶I‑SceI特异识别作用位点、oriColE1复制原点、能进行接合转移的敲除质粒骨架；（2）分别选择目标敲除基因上、下游长度为0.5～2.0kb的同源序列作为上、下游同源臂，设计引物进行PCR扩增，经限制性内切酶酶切后，按照在基因组上的方向分别克隆到敲除质粒骨架的多克隆位点中，构建目标基因的敲除质粒；（3）将目标基因的敲除质粒转化具有接合转移功能的E.coli S17‑1λpir作为供体菌，分别收集培养至对数中期的供体菌细胞和对数后期的A.thiooxidans受体菌细胞，按照供体菌:受体菌为1:1～1:2的比例混匀，涂在放置于Starkey‑Na2S2O3接合培养基平板的滤膜上，28～32℃培养5～9天，用Starkey‑Na2S2O3无机盐溶液将滤膜上的菌体洗脱下来，经梯度稀释后涂布到含80～150ug/mL卡那霉素的Starkey‑Na2S2O3固体培养基平板上，28～32℃培养10～15天，获得具有卡那霉素抗性的接合转移子即A.thiooxidans单交换子；（4）以X‑gal作为底物，对单交换子进行蓝色菌落验证，进一步设计引物对蓝色菌落的单交换子进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证，证明单交换子发生了第一次同源重组使目标基因的敲除质粒整合到受体菌染色体上；（5）构建含有酵母核酸内切酶I‑SceI基因、链霉素抗性基因以及接合转移功能的广泛宿主范围特性的质粒，作为诱导质粒；（6）将诱导质粒转化具有接合转移功能的E.coli S17‑1λpir作为供体菌，以A.thiooxidans单交换子作为受体菌，分别收集培养至对数中期的供体菌细胞和对数后期的受体菌细胞，按照供体菌:受体菌为1:1～1:2的比例混匀，涂在放置于Starkey‑Na2S2O3接合培养基平板的滤膜上，28～32℃培养48～72h后，用Starkey‑Na2S2O3无机盐溶液将滤膜上的菌体洗脱下来，经梯度稀释后涂布到含80～150ug/mL链霉素的Starkey‑Na2S2O3固体培养基平板上,28～32℃培养10～15天，获得导入诱导质粒的接合转移子；（7）以X‑gal作为底物，对获得的接合转移子进行白色菌落初筛，进一步设计引物对白色菌落的双交换子进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳筛选验证，获得发生第二次同源重组且实现目标基因敲除的A.thiooxidans突变株；（8）对验证的目标基因敲除突变株在不添加抗生素的无选择压力条件下转接3～5次连续传代培养，获得诱导质粒丢失的A.thiooxidans目标基因敲除突变株；其特征是：步骤（1）所述构建含有大肠杆菌β‑半乳糖苷酶基因lacZ、酵母核酸内切酶I‑SceI特异识别作用位点、oriColE1复制原点、能进行接合转移的敲除质粒骨架的方法是：选择含有卡那霉素抗性基因、含有多克隆位点MCS便于同源臂的插入、含有接合转移元件oriT区便于通过接合转移进入A.thiooxidans细胞、含有18bp的酵母核酸内切酶I‑SceI特异识别作用位点便于诱发第二次同源重组、含有oriColE1复制原点、不能在A.thiooxidans中自主复制的 大肠杆菌质粒，插入大肠杆菌β‑半乳糖苷酶基因lacZ获得敲除质粒骨架；步骤（4）所述以X‑gal作为底物，对单交换子进行蓝色菌落验证，进一步设计引物对蓝色菌落的单交换子进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证，证明单交换子发生了第一次同源重组使目标基因的敲除质粒整合到受体菌染色体上的方法是：将0.5～1.5uL的5～20mg/mL无菌X‑gal溶液，滴加到卡那霉素抗性平板上的单菌落表面，28～35℃放置20～40min，挑取蓝色菌落至10～20uL无菌水中，取0.5～1.5uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证；将验证正确的菌液接种到20mL含250～400ug/mL卡那霉素的Starkey‑S0液体培养基中，28～35℃培养5～7天后转接到100mL含250～400ug/mL卡那霉素的Starkey‑S0液体培养基中，28～32℃培养5～7天；步骤（5）所述构建含有酵母核酸内切酶I‑SceI基因、链霉素抗性基因以及接合转移功能的广泛宿主范围特性的质粒，作为诱导质粒的方法是：选择具有广泛宿主范围特性的复制原点、能在E.coli和A.thiooxidans中均能自主稳定复制、拷贝数相对较高、携带链霉素抗性基因和接合转移元件oriT区的质粒；导入酵母核酸内切酶I‑SceI基因，构成携带I‑SceI基因的诱导质粒；步骤（7）所述以X‑gal作为底物，对获得的接合转移子进行白色菌落初筛，进一步设计引物对白色菌落的双交换子进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳筛选验证，获得发生第二次同源重组且实现目标基因敲除的A.thiooxidans突变株的方法是：挑取链霉素平板上的接合转移子单菌落至20mL含250～400ug/mL链霉素的Starkey‑S0液体培养基中，28～32℃培养5～7天，按5～10%的接种量转接20mL上述液体培养基中，28～32℃培养5～7天，取菌液稀释后涂布已涂布80～150uL的5～20mg/mL X‑gal的含80～150ug/mL链霉素的Starkey‑Na2S2O3培养基平板，28～32℃培养10～15天，挑取白色菌落至10～20uL无菌水中，取0.5～1.5uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，从中筛选和验证发生了双交换的突变株；将验证的突变株菌液接种到20mL Starkey‑S0液体培养基中，28～32℃培养5～7天，获得发生第二次同源重组且实现目标基因敲除的A.thiooxidans突变株；步骤（8）所述对验证的目标基因敲除突变株在不添加抗生素的无选择压力条件下转接3～5次连续传代培养，获得诱导质粒丢失的A.thiooxidans目标基因敲除突变株的方法是：将验证的目标基因敲除突变株稀释后涂布Starkey‑Na2S2O3培养基平板，28～32℃培养10～15天，挑取平板上的单菌落接种到20mL Starkey‑S0液体培养基中，28～32℃培养5～7天；再继续如上转接3～5次连续传代培养，挑取单菌落至10～20uL无菌水中，取0.5～1.5uL菌液作模板，设计引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证质粒丢失；上述Starkey‑Na2S2O3无机盐溶液配方为：(NH4)2SO46.0g/L，KH2PO26.0g/L，MgSO4﹒7H2O1.0g/L，CaCl2﹒2H2O0.5g/L，pH4.8，121℃灭菌20min；上述Starkey‑Na2S2O3固体培养基配方为：A液：(NH4)2SO40.6g，KH2PO20.6g，MgSO4﹒7H2O1.0g，CaCl2﹒2H2O0.05g，蒸馏水100mL，pH4.8，121℃灭菌20min；B液：琼脂粉2g，蒸馏水100mL，121℃灭菌20min；C液：Na2S2O32.0g，FeSO4﹒7H2O0.006g 溶解至10mL蒸馏水中，过滤除菌；A液和B液高压灭菌后冷却至80℃混合，再加入C液混合，制备固体平板；上述Starkey‑Na2S2O3固体接合培养基配方为：在上述Starkey‑Na2S2O3固体培养基配方A液中加入0.05％酵母粉；上述Starkey‑S0液体培养基配方为：(NH4)2SO42.0g/L，KH2PO23.0g/L，MgSO4﹒7H2O0.5g/L，CaCl2﹒2H2O0.25g/L，FeSO4﹒7H2O0.01g/L，浓H2SO4调节至pH2.5，121℃灭菌20min；硫粉放入试剂瓶中密闭，煮沸3h灭菌，接种后按10g/L加入培养基中。