[发明专利]光谱学测定在脂立方样品中膜蛋白稳定性的方法

摘要

本发明是一种光谱学测定在脂立方样品中膜蛋白稳定性的方法，该方法将纯化后的目标蛋白均匀混入脂立方样品后，对样品进行一个温度逐级升高的梯度加热/冷却过程。每一步升温后，水分子会析出脂立方样品而使样品变得浑浊，因此重新冷却样品并高速离心，使水分子重新进入脂立方，让样品变回无色透明状态。然后通过采集样品的荧光信号，鉴定目标蛋白的稳定性。本发明方法设计合理，可操作性强，可以实现在脂立方样品中直接测定蛋白的稳定性，为随后的晶体和相关研究提供了数据和理论的支持。本发明方法中应用的基因也可以为蛋白已经各类小分子的控制研究提供支持。

主权项

一种光谱学测定在脂立方样品中膜蛋白稳定性的方法，其特征在于，其步骤如下：（1）表达和纯化目标蛋白；在NCBI网站上输入目标膜蛋白名称搜索序列，得到目标膜蛋白的全长基因序列；将全长序列导入相关细胞表达系统，然后进行纯化，得到纯化后的膜蛋白溶液；（2）将膜蛋白溶液混入脂立方样品；①将纯甘油一油酸酯或者甘油一油酸酯与下述脂类分子中的一种组成的混合物从‑20℃的冰箱取出中，加热至37‑40℃后形成液态；前述脂类分子选自1,2 ‑ 二油酰‑sn‑甘油‑3 ‑ 磷酸胆碱，1,2‑二油酰‑SN‑甘油基‑3‑磷脂酰乙醇胺，1,2‑二油酰‑sn‑甘油基‑3 ‑ 磷脂酰甘油，1,2‑二油酰‑SN‑甘油基‑3‑磷脂酰丝氨酸或者胆固醇；其中，纯甘油一油酸酯占混合物质量的90%以上；②将液态甘油一油酸酯或者混合物转移到玻璃针管中冷却至20‑24℃，并立即与膜蛋白溶液混合得到膜蛋白溶液样品，将膜蛋白溶液样品推过注射器的连接器以形成均匀的脂立方样品；脂立方样品中膜蛋白的最终浓度为0.5‑2.0毫克/毫升，脂立方样品中水的重量百分比为38‑42％；同时以不含前述膜蛋白的缓冲液作对照；③当一个均匀和透明的脂立方样品形成后，将50‑70微升的脂立方样品转移到石英比色皿中，密封；在5600×g和18‑22℃的条件下离心；（3）膜蛋白在脂立方样品中的稳定性测定；采集石英比色皿中脂立方样品的初始吸光度和内在蛋白荧光光谱后，立即对样品进行升温，升温采用5‑10℃为一升温梯度循序进行，每一梯度升温进行后，需要采用前述方法离心并进行吸光度和内在蛋白荧光光谱采集；升温的最高温度不超过100℃；以不含膜蛋白的缓冲液按前述方法进行对照；将采集的吸光度和内在蛋白荧光光谱一起以图表画出，即可得到蛋白的退火温度；退火温度越高说明膜蛋白温度性越高，反之亦然；从而实现膜蛋白稳定性的测定。