[发明专利]一种花生中逆境胁迫AhMYBL6基因的克隆及功能表达方法

摘要

本发明涉及了一种花生中逆境胁迫AhMYBL6基因的克隆及功能表达方法，通过材料的准备与处理、RNA的提取和cDNA的合成、使用RT-PCR进行克隆合成出了逆境胁迫AhMYBL6基因，该基因开放阅读框为858bp，共编码286个氨基酸；基因氨基酸序列与大豆的MYB家族蛋白GmMYB4,GmMYB29,GmMYB29A2同源性均达到了60%以上。通过荧光定量PCR验证了AhMYBL6在低温，盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式，AhMYBL6在各种胁迫处理1h后表达量均有明显提高，并且此后一直维持在较高的水平，在低温处理的叶片中AhMYBL6的表达量最高提高了20多倍，将该基因通过转基因手段导入花生中，转基因植株比对照具有明显的耐冷、耐盐和抗旱特性，AhMYBL6基因能显著提高花生的抗逆性。

主权项

一种花生逆境胁迫AhMYBL6基因的克隆方法，主要包括以下步骤：（1）材料的准备与处理：材料选择花生花育19，花生种子在营养土和蛭石以2：1混合的土中萌发，萌发后幼苗生长条件为16h光照/8h黑暗，温度为22℃‑28℃，生长约2周处于三叶期的花生幼苗用于后续的非生物胁迫处理；材料的低温处理，将三叶期花生幼苗放入4℃光照培养箱中进行处理，取处理时间分别为0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h的花生叶片和根作为材料；对于耐盐用NaCl处理；对于抗旱，用PEG6000处理；将花生从土中取出并小心将根上的土用水冲洗干净，然后将花生根分别浸泡在200mM NaCl或重量浓度为20%PEG6000溶液中，在处理0h，1h，3h，h，12h，24h，48h和72h分别取花生的根作为材料，所有材料均保存于‑80℃超低温冰箱中备用；（2） RNA的提取和cDNA的合成按照试剂盒操作手册的方法用天根的RNeasy Mini Kit分离提取花生幼苗cDNA，用RQ1 RNase‑free DNaseI将得到的RNA去除DNA污染后再进行cDNA的合成；用M‑MLV Reverse Transcriptase进行cDNA的合成，25‑μL反应体系中包含2 μg RNA，在42°C条件下经过60 min的反转录反应后将反转录产物置于冰上放置5 min，之后将反转录产物于‑20℃低温冰箱中保存备用；（3）AhMYBL6基因克隆通过RT‑PCR进行克隆，PCR扩增所用的聚合酶为LA TaqTM DNA polymerase，在25‑μL体系中加入以下成分：含MgCl2的2.5 μL 10× PCR buffer ；2.5 μL 10 mM dNTPs；1 μL cDNA 模板；0.5 μL LA polymerase和17.5 μL ddH2O；PCR反应条件为：(a) 94℃，5 min；(b) 94℃，45 s；55℃，45 s；72℃，90 s；共35 cycles； (c) 72℃， 10 min；扩增基因全长所用引物为AhMYB6‑S: 5’‑GAAGCAAAGATGGTGA GA‑3’和AhMYB6‑A: 5’‑AGCCCTAATCAAAGACGA‑3’；PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分离后用Axygen胶回收试剂盒进行纯化，纯化产物连接pMD18‑T Easy vector 并测序。