[发明专利]焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法

摘要

本发明公开了一种焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法，属于食源性寄生虫的检测技术领域，首先依据贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase，tim)设计特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的脱氧核糖核酸(DNA)，然后分别以tim基因的特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，若引物扩增片段长度为165bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有贾第鞭毛虫。本发明适用于对贾第鞭毛虫进行快速检测确证，可广泛应用于环境中的水质监控、人体粪便中卵囊检测及进出口贸易中该类原虫的确证。

主权项

一种焦磷酸测序技术检测贾第鞭毛虫的方法，其特征在于，首先依据贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase，tim)设计特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的脱氧核糖核酸(DNA)，然后分别以tim基因的特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，若引物扩增片段长度为165bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据PCR扩增结果和焦磷酸测序结果来判定样品中是否含有贾第鞭毛虫；所述的设计贾第鞭毛虫的特异性引物及焦磷酸测序引物是根据该虫的磷酸丙糖异构酶基因序列，选取保守序列，通过Assay Design SW软件设计特异性引物序列，以扩增出特异性单一条带，再根据扩增区域中包含的特异核苷酸序列(目标序列)设计焦磷酸测序引物以确证是否为贾第鞭毛虫；贾第鞭毛虫PCR及测序引物为：tim基因上游引物5’‑AATGTGTACCTAGAGGGGAACG‑3’，5’进行生物素标记tim基因下游引物5’‑CTTTTCCAGGGCACGCTTA‑3’，tim基因测序引物5’‑TCCAGGGCACGCTTA‑3’；贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶的目标序列：GCCTTCTTGG CGCTTTGCTCGTCGGTCTCC；扩增片段长度为165bp。